p16與survivin蛋白在食管癌中的表達(dá)及意義

1/1p16與survivin蛋白在食管癌中的表達(dá)及意義p16與survivin蛋白在食管癌中的表達(dá)及意義作者：

宋長(zhǎng)山，譚家駒，趙建亭，劉曉萍【摘要】［目的］探討食管癌中p16與survivin蛋白的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。

［方法］采用EnVision免疫組化法檢測(cè)62例食管癌及其相應(yīng)癌旁正常黏膜組織的p16與survivin蛋白的表達(dá)。

［結(jié)果］癌旁正常黏膜中的p16與survivin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為91.9%和6.45%，而相應(yīng)癌組織分別為32.3%和72.6%。

兩組間均有顯著性差異（Plt;0.01）。

食管癌中p16表達(dá)的缺失與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（Plt;0.05）。

而survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)則與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（Plt;0.05），而與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期無(wú)關(guān)（Pgt;0.05）。

p16與survivin蛋白在食管癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.495，Plt;0.01)。

［結(jié)論］p16表達(dá)的缺失與survivin蛋白的過(guò)度表達(dá)與食管癌的發(fā)生、進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，兩者聯(lián)合檢測(cè)有助于食管癌病情的評(píng)估和預(yù)后判斷。

【關(guān)鍵詞】食管腫瘤食管癌的發(fā)生和發(fā)展與癌基因的激活、抑癌基因的失表達(dá)、細(xì)胞的凋亡失衡等有關(guān)。

p16基因是第一個(gè)被證明為參與細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的抑癌基因，其編碼生成的16kD的p16蛋白是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)物[1]。

Survivin基因是凋亡抑制基因的新成員，高表達(dá)于多種腫瘤組織和轉(zhuǎn)化細(xì)胞，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)[2]。

我們運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)p16與survivin蛋白在62例食管癌中的表達(dá)情況，分析其與相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1材料與方法1.1一般資料本組62例，男性45例，女性17例，年齡46～70歲，中位年齡59.2歲。

術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放療和化療，手術(shù)切除后病理證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌。

高、中、低分化者分別為18例、23例、21例。

TNM分期為Ⅱ期25例、Ⅲ期25例、Ⅳ期12例。

病理證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者43例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例。

癌旁正常黏膜組織均超過(guò)癌腫邊緣5cm。

1.2試劑與方法鼠抗人多克隆抗體p16和兔抗人survivin多克隆抗體購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司，EnVision試劑盒為DAKO公司產(chǎn)品(購(gòu)自上?；蚬?。

EnVision免疫組化法步驟如下：

①石蠟切片脫蠟至水；②切片經(jīng)修復(fù)熱處理放入Citrate緩沖液(0.01mol/L，pH6.0)，微波煮沸10min；③經(jīng)蒸餾水洗后，入3%過(guò)氧化氫5min；④蒸餾水沖洗后，再經(jīng)TBS緩沖液沖洗，一抗溫育30min；⑤經(jīng)TBS緩沖液沖洗后，多聚物二抗EnVision溫育30min；⑥TBS緩沖液沖洗后，DAB顯色，鏡下控制；⑦經(jīng)蒸餾水沖洗后，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封固。

TBS代替一抗作陰性對(duì)照，選取已知陽(yáng)性表達(dá)的組織作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3結(jié)果判斷p16表達(dá)以胞核或胞核和胞漿出現(xiàn)粗細(xì)不等、深淺不一的棕黃色顆粒為陽(yáng)性，而只見(jiàn)胞漿陽(yáng)性表現(xiàn)為非特異性染色。

Survivin表達(dá)的陽(yáng)性信號(hào)為胞漿內(nèi)或胞核內(nèi)出現(xiàn)淺黃色微細(xì)顆?！攸S色顆粒。

根據(jù)陽(yáng)細(xì)胞百分比分5個(gè)等級(jí)：

陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)lt;5%為0；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～5%為3分；gt;75%為4分。

染色強(qiáng)度分為：

0分為無(wú)色；1分為淡黃色；2分為棕色；3分為棕褐色。

總分計(jì)算方法為：

陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分值乘以染色強(qiáng)度所得分值的乘積。

總分0～1分為陰性(-)；2～5分為輕度陽(yáng)性(+)；6～8分為中度陽(yáng)性(++)；9～12分為重度陽(yáng)性(+++)。

1.4統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行2檢驗(yàn)和精確概率法。

2結(jié)果2.1p16與survivin蛋白在食管癌組織中的表達(dá)62例食管癌旁正常黏膜組織中p16和survivin的陽(yáng)性表達(dá)率分別為91.9%和6.45%，而相應(yīng)癌組織分別為32.3%和72.6%。

兩者在兩組間表達(dá)差異有顯著性（Plt;0.05）。

見(jiàn)表1。

高、中、低分化組p16陽(yáng)性表達(dá)率分別為55.6%、26.1%、19.1%。

p16的表達(dá)率隨著惡性程度的增高而降低，高分化組p16表達(dá)明顯高于中、低分化組(Ｐl(wèi)t;0.05)；而survivin在高、中、低分化組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為66.7%、73.9%和76.2%，各組間的表達(dá)差異無(wú)顯著性（Pgt;0.05）。

Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期p16的陽(yáng)性表達(dá)率分別為52%、20%、16.7%。

Ⅱ期組p16表達(dá)明顯高于Ⅲ、Ⅳ期(Ｐl(wèi)t;0.05)。

而survivin在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.0%、80.8%和81.8%（Pgt;0.05）。

淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移患者中p16的陽(yáng)性表達(dá)率分別為20.1%和57.9%，兩組間有顯著性差異（Plt;0.01）。

Survivin在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移患者中分別為81.4%和52.6%，兩組間亦有顯著性差異(Ｐl(wèi)t;0.05)。

2.2Survivin與p16蛋白在食管癌中表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析，survivin和p16蛋白在食管癌組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=0.495，Plt;0.01）。

見(jiàn)表2。

3討論正常細(xì)胞內(nèi)p16蛋白是CDKs的抑制蛋白，能特異性地在G1卡點(diǎn)中與cyclinD1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CDK4/6，抑制cyclinD1/CDK4/6復(fù)合物的蛋白激酶活性，阻止細(xì)胞通過(guò)G1/S期限制點(diǎn)進(jìn)入S期，細(xì)胞停滯在G1期，從而使細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。

p16蛋白表達(dá)缺失可出現(xiàn)于多種惡性腫瘤組織中，因此p16基因又稱(chēng)多瘤抑制基因[3]。

在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，p16基因出現(xiàn)突變、缺失或啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化后可導(dǎo)致p16蛋白的非正常表達(dá)，出現(xiàn)cyclinD1與CDK4/6結(jié)合增加，細(xì)胞增殖失控,從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。

多項(xiàng)研究表明食管癌組織中存在p16基因突變和甲基化，從而導(dǎo)致p16蛋白的表達(dá)缺失。

Chen等[5]研究了69例食管癌發(fā)現(xiàn)33例存在ｐ16基因的突變，突變后的p16基因直接改變了表達(dá)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致活性的喪失。

Fukuoka等[6]研究認(rèn)為p16基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化在食管癌中也存在較高的頻率。

本組結(jié)果顯示食管癌組織中ｐ16陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁正常食管黏膜組織（Ｐl(wèi)t;0.05），提示在食管癌組織中存在明顯的ｐ16蛋白失表達(dá)。

同時(shí)ｐ16陽(yáng)性表達(dá)率隨著食管癌的惡性程度和ＴＮＭ分期的增加而逐漸降低，在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移兩組間亦存在顯著性差異(Ｐl(wèi)t;0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者ｐ16基因蛋白表達(dá)率顯著降低。

這些均提示ｐ16蛋白的表達(dá)缺失在食管癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生了重要的作用。

因此ｐ16基因的異常可能是貫穿食管癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一個(gè)分子事件，ｐ16基因蛋白檢測(cè)可作為臨床輔助診斷食管癌、判定惡性程度、估計(jì)預(yù)后的輔助指標(biāo)。

Survivin蛋白是凋亡蛋白抑制因子(inhibitorofapoptosisproteins,IAP)家族的新成員，基因定位于染色體17q25，有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子構(gòu)成，編碼142個(gè)氨基酸組成的分子量16.5kD的蛋白質(zhì)，是迄今為止最小的hIAP蛋白。

Survivin通過(guò)特異性地與caspase-3和caspase-7結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)化為有活性的半胱天冬蛋白酶，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗凋亡作用[7]。

也可與細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4形成復(fù)合體，使p21從CDK4復(fù)合體釋放出來(lái)，p21進(jìn)一步與線(xiàn)粒體caspase-3結(jié)合抑制其活性，間接對(duì)抗細(xì)胞的凋亡。

在人類(lèi)胚胎發(fā)育組織和絕大多數(shù)惡性腫瘤組織中均有survivin表達(dá)，且與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，但不表達(dá)于終末分化的成人組織中[8]。

Tanaka等[9]研究表明survivin基因可能是DNA去甲基化酶作用的靶點(diǎn)之一，其蛋白通過(guò)基因去甲基化表觀(guān)遺傳學(xué)模式來(lái)上調(diào)表達(dá)。

Mega等[10]檢測(cè)食管癌組織的survivin陽(yáng)性表達(dá)率為56%（68/122），陽(yáng)性表達(dá)患者明顯預(yù)后不良，可認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在食管癌組織中survivin的陽(yáng)性表達(dá)率為72.6％，而癌旁的正常黏膜組織僅有6.45%，兩者之間差異有顯著性（Plt;0.01）。

表明survivin基因在食管癌組織中的表達(dá)上調(diào)。

提示其可能通過(guò)抑制食管癌細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失控和惡性化。

同時(shí)本組有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移survivin陽(yáng)性率(81.4％)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(52.6%)，兩組間差異有顯著性，說(shuō)明survivin可以抑制食管癌細(xì)胞自身的凋亡過(guò)程，使得食管癌惡性程度的增強(qiáng)，導(dǎo)致食管癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

提示survivin基因的過(guò)度表達(dá)可能是食管癌發(fā)生中較早期出現(xiàn)的分子異常事件，可作為判斷食管癌生物學(xué)行為的一個(gè)指標(biāo)[11，12]。

本組研究中顯示p16和survivin基因在食管癌組織和相應(yīng)癌旁正常黏膜組織的表達(dá)呈顯著性負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），兩者可能協(xié)同參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展。

因此同時(shí)檢測(cè)兩者的表達(dá)有助于進(jìn)一步了解食管癌的生物學(xué)行為，并為判斷食管癌的淋巴轉(zhuǎn)移、預(yù)后評(píng)估提供有價(jià)值的參考指標(biāo)。

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