科技支撐計劃可行性研究報告提綱

PAGEPAGE12010年南昌市科技支撐計劃項目可行性研究報告項目名稱：治療角膜病的漢防己甲素申報單位：南昌弘益科技有限公司（蓋章）項目聯(lián)系人：熊艷君電話13970091856通訊地址：江西省南昌國家高新開發(fā)區(qū)火炬大街789號郵政編碼：330096

治療角膜病的漢防己甲素可行性研究報告一、選題的必要性（一）項目所處技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)政策本項目是漢防己甲素新的給藥途徑治療角膜病創(chuàng)新藥物，具有自主知識產(chǎn)權(quán)，屬于國家《當(dāng)前優(yōu)先發(fā)展的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化重點領(lǐng)域》和《國家重點支持的高新技術(shù)領(lǐng)域》，是《國家產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄》、《國家產(chǎn)業(yè)技術(shù)政策》和江西省“六個一”工程十大戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃鼓勵發(fā)展的產(chǎn)業(yè)和產(chǎn)品。（二）項目所處技術(shù)領(lǐng)域的國內(nèi)外現(xiàn)狀和技術(shù)發(fā)展趨勢角膜病是我國的主要致盲眼病之一。角膜疾病主要有炎癥、外傷、先天性異常、變性、營養(yǎng)不良和腫瘤等。其中感染性角膜炎癥占有重要地位。肺炎球菌較易直接感染角膜，其它病原菌則需要大量局部侵襲或機體抵抗力下降時才易致病。角膜緣血供豐富，角膜周邊部和中央部之間在免疫相關(guān)的細胞和活性因子的分布上存在顯著差異，角膜周邊部或角膜緣的淋巴細胞以及補體成分含量高于角膜中央部。此外角膜的周邊和角鞏緣含有抗原提呈細胞——樹突狀細胞（表達MHC-II和共刺激分子，能有效的活化T細胞）。周邊上皮層和角膜前基質(zhì)層，存在少量的淋巴細胞。血管黏附分子和細胞因子也可以把血管內(nèi)不同類別的白細胞吸引到角膜緣。因此，臨床上角膜周邊部或角膜緣易發(fā)生免疫性角膜病（如蠶蝕性角膜潰瘍、泡性角結(jié)膜炎和邊緣性角膜潰瘍等），而一些感染性角膜病則易發(fā)生于角膜中央?yún)^(qū)。角膜上皮是抵御病原微生物侵襲角膜的第一道屏障，上皮遭受損傷后，極容易發(fā)生感染性炎癥。上皮層損傷后可以再生，不留瘢痕。角膜前彈力層受損后不能再生，由上皮細胞或瘢痕組織填充。角膜基質(zhì)層對維持角膜的透明性及抵抗眼力壓有重要作用，損傷后由瘢痕組織修復(fù)填補，使角膜失去透明性。角膜后彈力層受損后可以由內(nèi)皮細胞分泌再生，修復(fù)速度為每月10μm，接近正常厚度。內(nèi)皮細胞的屏障功能遭到破壞后，傷口緣的Descemet's膜收縮并向基質(zhì)層卷曲，數(shù)小時之內(nèi)，毗鄰的內(nèi)皮細胞向傷口區(qū)遷徙，通過細胞重組、增大和遷徙，重建完整的內(nèi)皮單層結(jié)構(gòu)。當(dāng)完整的單層內(nèi)皮細胞重新覆蓋Descemet's膜時，細胞間形成接觸抑制和穩(wěn)定的細胞連接。此時，參與創(chuàng)傷修復(fù)的細胞體積大于未參與修復(fù)區(qū)域的細胞。如果內(nèi)皮損傷較重，局部的內(nèi)皮細胞會形成復(fù)層及纖維化，引起異常的基底膜樣物質(zhì)沉積。角膜是重要的光學(xué)通路，角膜病尤其是位于角膜中央的病灶，嚴(yán)重影響視力，所以角膜病要給予積極的治療。角膜各層對局部使用藥物的滲透性不同，脂溶性物質(zhì)可以迅速通過緊密連接的上皮層，水溶性物質(zhì)易于通過基質(zhì)層。因此，為了提高藥物眼部使用的生物利用度，理想藥物應(yīng)具備雙相溶解性方能穿透角膜進入眼內(nèi)。角膜移植是重要的復(fù)明及治療手段，角膜免疫學(xué)上處于相對的“赦免狀態(tài)”，角膜的免疫赦免包含以下幾種因素：①無血管，免疫效應(yīng)因子無法輸送。②無淋巴管，抗原和抗原提呈細胞無法進入局部淋巴結(jié)。③表達免疫抑制因子，包括TGF-β。④表達Fas配體，對活化的淋巴細胞可以誘導(dǎo)Fas介導(dǎo)的凋亡。但角膜仍存在著參與免疫反應(yīng)的各種成分如T、B淋巴細胞，朗罕氏細胞、免疫球蛋白、補體以及組織相容性抗原等。因此，雖然角膜移植是器官移植中成功率最高的一種。但在某些抗原刺激下，尤其當(dāng)病變角膜出現(xiàn)新生血管時，角膜移植亦出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。因此，藥物仍然是治療角膜病的重要方法。角膜病治愈后遺留厚薄不等的瘢痕。淺層的瘢痕性混濁如云霧狀，通過混濁部分仍能看清后面虹膜紋理者稱角膜云翳?；鞚彷^厚略呈白色，但仍可透見虹膜者稱角膜斑翳?；鞚岷芎癯蚀砂咨?，不能透見虹膜者稱角膜白斑。如果角膜瘢痕組織中嵌有虹膜組織時，使形成粘連性角膜白斑，提示病變角膜有穿破史。若白斑面積大，而虹膜又與之廣泛粘連，則可能堵塞房角，房水流出受阻致使眼壓升高，引起繼發(fā)性青光眼。高眼壓作用下，混雜有虹膜組織的角膜瘢痕膨出形成紫黑色隆起，稱為角膜葡萄腫。角膜斑翳對視力的影響與發(fā)生的部位有關(guān)，如斑翳在中央部位遮蔽了瞳孔，既使很薄，也嚴(yán)重影響視力，因此必須及時治療。對角膜斑翳有不少治療方法，至今仍選擇使用的有球結(jié)膜下注射高滲水、碘離子導(dǎo)入、狄奧寧和黃降泵軟膏局部應(yīng)用等治療方法，雖有一定效果，但都不夠滿意，效療低，有的操作不便，有的有副作用。角膜斑翳是角膜病治愈后遺留的瘢痕，瘢痕形成時，角膜的吸收功能降低，在這種情況下斑翳也就難以消散。目前，世界上治療角膜病，特別治療角膜斑翳方法和藥物極為有限，開發(fā)有效的治療藥物具有重要的社會意義和經(jīng)濟效益。漢防己甲素又稱粉防己堿，是從防己科千金藤屬植物StephaniatetrandraS.moore的塊根中分離出的主要生物堿，屬于雙芐基異喹啉類化合物，早期在臨床上主要用于治療早期輕度高血壓，亦可用于重癥高血壓及高血壓危象。目前，漢防己甲素在臨床上用于抗風(fēng)濕及抗腫瘤輔助治療取得較好的療效，臨床應(yīng)用的劑型有注射液和片劑。近年來的研究證實漢防己甲素是天然的非選擇性鈣通道阻滯劑，又是鈣蛋白的拮抗劑，除了抗炎作用機制外，還可作為有效IL-1阻滯劑而不是花生四烯酸阻滯劑抗眼部炎癥反應(yīng)，甚至其效能超過糖皮質(zhì)激素，而且，漢防己甲素還通過非競爭性方法顯著抑制內(nèi)毒素，有效用于治療眼部炎癥，包括葡萄膜炎，角膜炎等，以及其導(dǎo)致的視網(wǎng)膜病變。另外，漢防己甲素對白內(nèi)障、青光眼、視網(wǎng)膜疾病、眼內(nèi)腫瘤等眼疾病都有一定的藥理作用，對眼部炎癥、青光眼、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變和視網(wǎng)膜母細胞瘤有良好的治療作用，但未見漢防己甲素用于角膜病，特別是角膜斑翳的報道。（三）項目技術(shù)先進性，對相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)進步的推動作用1、漢防己甲素用于角膜病的機理研究處于國際領(lǐng)先水平研究結(jié)果表明，漢防己甲素通過將細胞周期停滯在G0/G1期和誘導(dǎo)細胞凋亡而抑制角膜基質(zhì)細胞增殖，并能減少纖維連接蛋白在兔角膜基質(zhì)細胞間的堆積而發(fā)揮作用。體外動物實驗結(jié)果表明，漢防己甲素通過減少TGF-β1的表達和抑制NF-ΚB的活性以及減少細胞外基質(zhì)（ECM）的生成，對兔準(zhǔn)分子激光角膜屈光術(shù)（PPK）后角膜上皮下霧狀混濁（Haze）形成有明顯抑制作用。通過不同濃度漢防己甲素的對比研究，篩選出0.1%濃度漢防己甲素為最低有效濃度；同時，運用描述性毒理學(xué)進一步證實0.1%及以下濃度漢防己甲素對兔眼眼組織無刺激性、毒性，應(yīng)可安全用于眼部，0.3%漢防己甲素為最高耐受濃度，而漢防己甲素在眼部較長時間使用不會引起眼壓升高。2、漢防己甲素用于角膜病的藥效研究處于國際領(lǐng)先水平研究結(jié)果表明，漢防己甲素對細菌性角膜炎、角膜煙曲菌病、痢疾桿菌誘發(fā)的角膜炎、角膜斑翳有顯著治療作用。3、漢防己甲素滴眼液藥代動力學(xué)研究處于國際領(lǐng)先水平采用HPLC法研究漢防己甲素滴眼液在兔眼部的藥代動力學(xué)，結(jié)果表明，漢防己甲素滴眼液單次滴眼后，在淚液中迅速消除；在眼內(nèi)各組織中，漢防己甲素在角膜中的濃度最大，在角膜中的AUC遠遠大于其他眼內(nèi)組織的AUC值，約為房水中的AUC的8倍、虹膜睫狀體AUC的5倍、晶體狀A(yù)UC的15倍、玻璃體AUC的25倍，說明漢防己甲素進入眼內(nèi)的藥物大部蓄積在角膜組織中，進入眼內(nèi)其他組織的量相對較少。漢防己甲素滴眼液單次滴眼后，在兔眼各組織中的藥物濃度變化均符合血管外給藥一室模型一級動力學(xué)過程。漢防己甲素滴眼液單次滴眼后，在角膜中能達到較高濃度，而且消除速率相對較慢。漢防己甲素在眼部的這種代謝特點為開發(fā)治療角膜病的滴眼液提供了重要依據(jù)。本項目研究開發(fā)了一種治療角膜病的創(chuàng)新藥物，作為自主創(chuàng)新的經(jīng)濟增長點，對于正確引導(dǎo)我國醫(yī)藥行業(yè)藥物研究開發(fā)，促進產(chǎn)業(yè)技術(shù)升級和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)調(diào)整具有積極的作用。（四）項目目前進展情況及市場分析1、項目目前進展情況對漢防己甲素用于角膜病的機理以及治療角膜炎、角膜斑翳等角膜病的作用進行了探索性研究，并對漢防己甲素眼部用藥的藥代動力學(xué)進行了基礎(chǔ)性研究，選擇漢防己甲素滴眼液作為治療角膜病的劑型，開展?jié)h防己甲素滴眼液藥學(xué)、藥理毒性學(xué)和藥效學(xué)研究。2、項目產(chǎn)品市場分析角膜病是我國的主要致盲眼病之一，但治療方法和藥物極其有限。本項目治療角膜病的漢防己甲素滴眼液具有顯著的藥物經(jīng)濟學(xué)價值和經(jīng)濟社會效益。治療角膜病的漢防己甲素滴眼液作為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新藥物，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究和上市報道，亦未見相關(guān)專利報道，預(yù)計其年銷售峰值將達8億元。二、技術(shù)方案論述（一）項目技術(shù)關(guān)鍵點或創(chuàng)新點論述，項目完成時達到的技術(shù)水平查新報告表明，將檢索到的文獻資料與本項目的查新點對比分析后得出結(jié)論：國內(nèi)未檢索到研發(fā)治療角膜病的漢防己甲素全身用藥制劑，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、混懸劑、注射劑；治療角膜病的漢防己甲素局部用藥制劑，包括黏膜給藥制劑、貼劑、透皮吸收劑、氣霧劑、噴霧劑、粉霧劑；以及治療角膜斑翳的漢防己甲素滴眼液的文獻報道。本項目的查新點具有新穎性。1、項目技術(shù)創(chuàng)新點論述1.1漢防己甲素用于角膜病作用機理研究結(jié)果表明，漢防己甲素通過將細胞周期停滯在G0/G1期和誘導(dǎo)細胞凋亡而抑制角膜基質(zhì)細胞增殖，并能減少纖維連接蛋白在兔角膜基質(zhì)細胞間的堆積而發(fā)揮作用。體外動物實驗結(jié)果表明，漢防己甲素通過減少TGF-β1的表達和抑制NF-ΚB的活性以及減少細胞外基質(zhì)（ECM）的生成，對兔準(zhǔn)分子激光角膜屈光術(shù)（PPK）后角膜上皮下霧狀混濁（Haze）形成有明顯抑制作用。通過不同濃度漢防己甲素的對比研究，篩選出0.1%濃度漢防己甲素為最低有效濃度；同時，運用描述性毒理學(xué)進一步證實0.1%及以下濃度漢防己甲素對兔眼眼組織無刺激性、毒性，應(yīng)可安全用于眼部，0.3%漢防己甲素為最高耐受濃度，而漢防己甲素在眼部較長時間使用不會引起眼壓升高。藥效研究結(jié)果表明，漢防己甲素對細菌性角膜炎、角膜煙曲菌病、痢疾桿菌誘發(fā)的角膜炎、角膜斑翳有顯著治療作用。1.2治療角膜病的漢防己甲素全身用藥制劑，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、混懸劑、注射劑。1.3治療角膜病的漢防己甲素局部用藥制劑，包括眼部給藥制劑、黏膜給藥制劑、貼劑、透皮吸收劑、氣霧劑、噴霧劑、粉霧劑。1.4漢防己甲素滴眼液處方及制備工藝。1.5治療角膜病的漢防己甲素滴眼液采用HPLC法研究漢防己甲素滴眼液在兔眼部的藥代動力學(xué)，結(jié)果表明，漢防己甲素滴眼液單次滴眼后，在淚液中迅速消除；在眼內(nèi)各組織中，漢防己甲素在角膜中的濃度最大，在角膜中的AUC遠遠大于其他眼內(nèi)組織的AUC值，約為房水中的AUC的8倍、虹膜睫狀體AUC的5倍、晶體狀A(yù)UC的15倍、玻璃體AUC的25倍，說明漢防己甲素進入眼內(nèi)的藥物大部蓄積在角膜組織中，進入眼內(nèi)其他組織的量相對較少。漢防己甲素滴眼液單次滴眼后，在兔眼各組織中的藥物濃度變化均符合血管外給藥一室模型一級動力學(xué)過程。漢防己甲素滴眼液單次滴眼后，在角膜中能達到較高濃度，而且消除速率相對較慢。漢防己甲素在眼部的這種代謝特點為開發(fā)治療角膜病的滴眼液提供了重要依據(jù)。2、項目完成時達到的技術(shù)水平治療角膜病的漢防己甲素制劑，特別是漢防己甲素滴眼液達到國際領(lǐng)先水平。（二）項目技術(shù)方案論述1、藥學(xué)研究1.1處方、工藝研究（1）制劑規(guī)格的確定根據(jù)本項目前期研究結(jié)果，確定漢防己甲素滴眼液的濃度分別為0.1%和0.3%，制劑規(guī)格分別為5ml：5mg和5ml：15mg。（2）處方篩選以漢防己甲素的溶解度、穩(wěn)定性和藥理活性為指標(biāo)，確定溶液的最佳pH值。通過穩(wěn)定性試驗篩選滲透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、抗氧劑、防腐劑和黏度劑的種類與用量，進行滲透壓調(diào)節(jié)，并結(jié)合眼刺激性試驗和藥效學(xué)研究，確定處方。①酸的篩選漢防己甲素為雙芐基異喹啉類生物堿，不溶于水，與酸形成可溶性鹽可改善其溶解度，分別對不同的酸及加入量進行篩選，在100℃②滲透壓調(diào)節(jié)劑的篩選常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑有氯化鈉、葡萄糖和甘露醇，分別按上述酸的加入量，用0.65%氯化鈉、5%葡萄糖和5%甘露醇做滲透壓調(diào)節(jié)劑，用10%氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.0，在100℃③緩沖劑的篩選為保證溶液的穩(wěn)定性，分別用適合眼用的磷酸鹽、硼酸-硼砂、硼酸-醋酸鈉為緩沖劑，調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.0，在100℃④溶液的pH值眼睛耐受的pH值范圍為5～9，pH值過高或過低都會對眼睛產(chǎn)生刺激性。漢防己甲素為生物堿，pH值大于7.5時有游離堿析出，溶液渾濁，所以可篩選的pH值范圍為5.0～7.0。按上述方法分別配制pH5.0、6.0、6.5和7.0的溶液，在100℃⑤抗氧劑的篩選適合pH值為6.0的眼用抗氧劑有維生素C、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉，常用量分別為0.02%～0.5%、0.1%～0.2%、0.025%～0.1%和0.01%～0.1%?？紤]到維生素C氧化變色，所以不選用，重點考察亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉和乙二胺四乙酸二鈉，用量分別為0.2%、0.3%和0.03%，用10%氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，在100℃⑥防腐劑的篩選適合pH為6.0的眼用防腐劑有苯扎氯銨和尼泊金乙酯。尼泊金乙酯在282nm波長處有強吸收，干擾漢防己甲素的含量測定。因此選用苯扎氯銨為防腐劑，并對其用量進行篩選。用量分別為0.01%、0.015%和0.02%，調(diào)節(jié)溶液的pH值為6.0，在100℃⑦黏度劑的選擇常用的眼用黏度劑有羥丙甲纖維素、聚乙烯吡咯烷酮K30。按照眼用黏度劑的常用量，用10%氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，在100℃⑧滲透壓調(diào)節(jié)采用滲透壓測定儀測量滲透壓，調(diào)整滲透壓調(diào)節(jié)劑的加入量，使為等滲（286mOsmol/kg）。（3）制備工藝研究①主藥和輔料的粉碎及粒徑驗證。②溶液的配制方法研究驗證。③溶液的pH值、滲透壓調(diào)節(jié)方法研究驗證。④溶液的無菌處理方法研究驗證。⑤半成品控制方法研究驗證。（4）影響因素試驗采用確定的處方、工藝制備的樣品，灌裝于聚酯滴眼液瓶中，分別在光照（4500LX）和高溫（40℃、60（5）凍融試驗為考察在運輸或使用過程中溫度對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，模擬藥品在運輸和使用過程中可能遇到的溫度條件，考察采用擬上市包裝的樣品的穩(wěn)定性。采用確定的處方、工藝制備的樣品，灌裝于聚酯滴眼液瓶中，熱循環(huán)三次，每次在-20℃～-10℃2天、然后在401.2中試放大生產(chǎn)研究按照處方、工藝研究結(jié)果，進行中試放大生產(chǎn)研究，進一步考察中試放大規(guī)模條件下的工藝技術(shù)參數(shù)，制備中試放大樣品。1.3工業(yè)化生產(chǎn)研究驗證根據(jù)中試放大生產(chǎn)研究結(jié)果，進一步在工業(yè)化生產(chǎn)條件下對廠房、設(shè)備、處方、工藝、清場清潔等進行驗證，工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)品。1.4質(zhì)量研究根據(jù)本品的理化特性，按照中國藥典2010年版二部附錄IG眼用制劑滴眼劑和中國藥典2010年版二部附錄XIXA藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法指導(dǎo)原則的規(guī)定，參照《化學(xué)藥物制劑研究基本技術(shù)指導(dǎo)原則》（【H】GPH4-1）、《化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)指導(dǎo)原則》（【H】GPH5-1）、《化學(xué)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的規(guī)范化過程技術(shù)指導(dǎo)原則》（【H】GPH1-1）的要求，對漢防己甲素滴眼液的外觀性狀、鑒別、可見異物、pH、裝量、滲透壓摩爾濃度、無菌、含量均勻度、雜質(zhì)和含量測定分析控制方法進行研究驗證，并對產(chǎn)品質(zhì)量進行分析檢測，為制定產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。1.5穩(wěn)定性研究根據(jù)本品的理化特性，按照中國藥典2010年版二部附錄XIXC原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則的規(guī)定，參照《化學(xué)藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（【H】GPH6-1）的要求，以外觀、有關(guān)物質(zhì)、pH和含量為指標(biāo)，考察采用擬上市包裝的樣品加速試驗（40℃，RH75%）6個月和長期試驗（252、藥理毒理研究已上市的漢防己甲素劑型為注射劑和片劑，適應(yīng)癥為抗風(fēng)濕藥及抗癌增效藥。治療角膜病的漢防己甲素滴眼液屬于增加新適應(yīng)癥、改變給藥途徑、改變已上市銷售的制劑劑型的化學(xué)藥品第1類新藥，是局部用藥制劑，根據(jù)《藥品注冊管理辦法》的規(guī)定，進行漢防己甲素滴眼液治療角膜病的相關(guān)主要藥效學(xué)和非臨床安全性研究。2.1主要藥效學(xué)研究（1）漢防己甲素滴眼液對細菌性角膜炎的作用用金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株感染新西蘭白兔，制成細菌性角膜炎動物模型，用比濁法測定細菌數(shù)，用生理鹽水為對照，觀察給予漢防己甲素滴眼后兔外眼形態(tài)學(xué)和角膜上細菌生長情況。（2）漢防己甲素滴眼液對角膜煙曲菌病的治療作用角膜劃痕后板層內(nèi)注射致角膜煙曲菌病。將煙曲菌懸液（106/ml）0.1ml注入新西蘭白兔一只眼角膜基層內(nèi)，至4mm區(qū)域水腫混濁為止，另一只眼以同法注入生理鹽水作為對照，制成角膜煙曲病動物模型，給予漢防己甲素滴眼液和0.25%氯霉素滴眼液，每日用裂隙燈觀察其角膜、前房、虹膜及晶體等變化，動物接種后分別于1、2、4、6、8、10、15、20、25及30天采用耳靜脈注射空氣法處死，立即取材制備組織學(xué)標(biāo)本。電鏡標(biāo)本僅限于1、2、4、6及8天者，同時取正常及對照眼角膜檢查。取材后，將角膜組織于Carnoy液中固定12小時，石蠟包埋，HE染色，用光鏡觀察。取材后，立即將角膜置入2.5%戊二醛液中固定2小時，然后切成4mm×5mm組織塊，經(jīng)梯度乙醇脫水、臨界點干燥及真空噴鍍金膜后用掃描電鏡觀察。將角膜組織于2.5%戊二醛液中固定2小時，切成2mm×3mm小塊，1%四氧化鋨后固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片定位后超薄切片，檸檬酸鉛及醋酸鈾雙重染色后于透射電鏡下觀察，評價漢防己甲素滴眼液對角膜煙曲菌病的治療作用。（3）漢防己甲素滴眼液對痢疾桿菌誘發(fā)的角膜炎的作用將有毒痢疾菌株的新鮮斜面培養(yǎng)物制成一定濃度的鹽水菌懸液，滴入豚鼠角膜結(jié)合膜囊內(nèi)，制成痢疾桿菌感染實驗動物模型，用生理鹽水作為對照，觀察漢防己甲素滴眼液對痢疾桿菌誘發(fā)角膜炎的作用。（4）漢防己甲素滴眼液對角膜斑翳的治療作用取經(jīng)視力檢查、角膜內(nèi)皮細胞形態(tài)和密度檢查、角膜地形圖檢查、裂隙燈檢查、A超檢查確定為角膜斑翳模型豚鼠，用漢防己甲素滴眼液每天3～6次，連續(xù)30天，用狄奧寧軟膏為對照。觀察漢防己甲素滴眼液對角膜斑翳的治療作用。2.2非臨床安全性研究（1）眼刺激性試驗以新西蘭白兔眼為動物模型，對漢防己甲素滴眼液的眼刺激性進行試驗。在體法用眼刺激性實驗評價眼刺激性，評價漢防己甲素滴眼液單次給藥或重復(fù)給藥的眼刺激性；離體法用角膜水化值為評價指標(biāo)，漢防己甲素滴眼液重復(fù)多次給藥角膜水化值的變化，對角膜的刺激性。（2）溶血性試驗取兔血，除去纖維蛋白原，使成脫纖血液。加入生理鹽水，搖勻，離心，除去上清液，沉淀的紅細胞再用生理鹽水洗滌至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用生理鹽水制成2%的混懸液，供試驗用。取漢防己甲素滴眼液作為供試品溶液；以生理鹽水為陰性對照，以蒸餾水為陽性對照，依次加入2%紅細胞懸液，立即置37℃±0.5℃2.3過敏性試驗（1）眼部被動過敏試驗用兔，用漢防己素滴眼液作為供試液，以牛血清白蛋白為陽性對照，以漢防己素滴眼液輔料生理鹽水溶液（除無漢防己素外，其它輔料和用量與漢防己素滴眼液相同）為陰性對照，腹腔注射制備抗血清。用生理鹽水稀釋抗體血清，滴入兔眼，進行被動致敏。被動致敏48小時后，各組靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量的1%伊文思蘭染料共1ml，進行激發(fā)。30分鐘后麻醉處死各組動物，觀察兔眼組織變化，評價漢防己素滴眼液的過敏情況。（2）全身主動過敏試驗用豚鼠，用漢防己素滴眼液作為供試液，以牛血清白蛋白為陽性對照，以漢防己素滴眼液輔料生理鹽水溶液（除無漢防己素外，其它輔料和用量與漢防己素滴眼液相同）為陰性對照，隔日一次腹腔注射，共3～5次，致敏。在末次注射后第14天快速靜脈注射給藥激發(fā)，激發(fā)劑量為致敏劑量的3～5倍。致敏期間每日觀察動物的癥狀。初次、最后一次致敏和激發(fā)當(dāng)日測定每組每只動物的體重。靜脈注射激發(fā)立刻至30分鐘，詳細觀察每只動物的過敏反應(yīng)癥狀，癥狀出現(xiàn)及消失時間。最長觀察3小時。判斷過敏反應(yīng)發(fā)生程度。計算過敏反應(yīng)發(fā)生率。根據(jù)過敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生程度進行綜合判斷。評價漢防己素滴眼液的全身主動過敏情況。（3）光過敏反應(yīng)試驗用白色豚鼠，設(shè)陽性對照和陰性對照組。眼內(nèi)滴入受試物，照射紫外線，每日操作一次，連續(xù)5日進行致敏，7～10天后，再次眼內(nèi)滴入受試物，照射紫外線進行激發(fā)。評價漢防己素滴眼液的光過敏反應(yīng)。2.4漢防己甲素滴眼液非臨床藥代動力學(xué)研究用微量注射器給新西蘭白兔雙眼結(jié)膜囊內(nèi)滴入50μl0.5%漢防己甲素滴眼液，輕輕閉合雙瞼約1min，滴眼后分別于0.167、0.5、1.0、1.25、1.5、2、2.5、3.0、4.0和12.0h耳緣靜脈栓塞處死動物，用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，立即抽取房水，取角膜組織，并用濾紙吸干后稱重。所有樣品均儲存于-20℃（1）角膜樣品的處理取兔眼角膜，生理鹽水沖洗表面，吸干水分，稱重，將角膜剪碎，加甲醇0.8ml，勻漿，漩渦混合3min，15000r·min-1離心20min，取上清液作為檢測液。（2）房水樣品處理取房水200μl，加入甲醇200μl，漩渦混合3min，15000r·min-1離心20min，取上清液作為檢測液。（3）角膜和房水中漢防己甲素濃度分析檢測方法研究驗證采用RP-HPLC法檢測角膜和房水中的漢防己甲素濃度，用甲醇沉淀蛋白質(zhì)。對分析檢測方法的線性、準(zhǔn)確性、精確性、耐用性、最低檢測限進行研究驗證，建立漢防己甲素在角膜和房水中的分析檢測方法。（4）藥代動力學(xué)參數(shù)測定測定漢防己甲素在兔眼角膜組織及房水中達峰時間、峰濃度、消除速率常數(shù)、吸收速率常數(shù)、清除半衰期、曲線下面積、淚液轉(zhuǎn)移率、淚液的初始藥物濃度，計算角膜上皮藥物的滲透系數(shù)，評價漢防己甲素在角膜組織與房水中藥物濃度變化的動力學(xué)模型、在角膜組織中的滲透性、在房水中的濃度變化過程，為制定臨床研究方案提供依據(jù)。3、臨床研究3.1臨床藥代動力學(xué)研究男性健康志愿者，采用LC-MS/MS分析檢測技術(shù)，測定漢防己甲素在人體眼角膜組織及房水中達峰時間、峰濃度、消除速率常數(shù)、吸收速率常數(shù)、清除半衰期、曲線下面積、淚液轉(zhuǎn)移率、淚液的初始藥物濃度，計算角膜上皮藥物的滲透系數(shù)，評價漢防己甲素在人體角膜組織與房水中藥物濃度變化的動力學(xué)模型、在人體角膜組織中的滲透性、在房水中的濃度變化過程，為臨床研究提供依據(jù)。3.2臨床研究（1）I期臨床試驗采用劑量遞增方案，在人體（主要是健康志愿者）進行不同劑量給藥，考察人體對漢防己甲素滴眼液的耐受性，找出人體可耐受的劑量，了解在此劑量下的不良反應(yīng)，為II期臨床研究推薦合適的劑量。（2）II期臨床試驗采用隨機、雙盲、多中心、安慰劑對照試驗方法，評價漢防己甲素滴眼液兩個劑量組治療角膜病的安全性和有效性，為III期臨床研究驗證推薦劑量。（3）III期臨床試驗采用隨機、雙盲、多中心、安慰劑對照試驗方法，用II期臨床試驗推薦的劑量，驗證漢防己甲素滴眼液治療角膜病的安全性和有效性，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。（三）項目技術(shù)質(zhì)量指標(biāo)1、項目產(chǎn)品達到的主要技術(shù)性能指標(biāo)1.1對眼部炎癥、青光眼、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜母細胞瘤、角膜病，特別是角膜斑翳有良好的治療作用。1.2漢防己甲素滴眼液成品率97%，漢防己甲素滴眼液含量大于95%，雜質(zhì)含量小于1.5%。1.3漢防己甲素滴眼液眼部給藥安全有效，質(zhì)量可控。2、項目產(chǎn)品執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。3、通過的國家相關(guān)行業(yè)許可認(rèn)證：漢防己甲素滴眼液通過藥品GMP認(rèn)證，取得《藥品GMP證書》。（四）分階段描述項目執(zhí)行過程中各階段目標(biāo)1、臨床前研究1.1時間：2010年1月～2011年12月1.2目標(biāo)：獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局申請臨床研究注冊《受理通知書》。2、臨床研究2.1時間：2013年6月～2014年12月2.2目標(biāo)：（1）獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進行臨床研究，完成臨床研究。（2）獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局申請生產(chǎn)注冊《受理通知書》。3、產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化3.1時間：2015年1月～2015年12月3.2目標(biāo)：（1）獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，取得《新藥證書》和《注冊批件》。（2）通過藥品GMP認(rèn)證，取得漢防己甲素滴眼液《藥品GMP證書》。（五）項目經(jīng)費預(yù)算情況項目總投資2540萬元。已完成投資80萬元，用于漢防己甲素滴眼液制劑、作用機理、藥效、藥代動力學(xué)研究。1、本項目須新增投資2460萬元，其投資構(gòu)成和投資預(yù)算如下：1.1項目研究、注冊等費用（1）藥學(xué)研究費用：包括處方工藝研究、質(zhì)量研究、穩(wěn)定性研究、樣品小試、中試和工業(yè)化生產(chǎn)等費用120萬元。（2）藥理毒理研究費用：160萬元。（3）非臨床藥代動力學(xué)研究費用：50萬元。（4）臨床藥代動力學(xué)研究費用：60萬元。（5）臨床研究費用：1000萬元。（6）申請臨床研究注冊復(fù)核檢驗和注冊審批費用：10萬元。（7）申請生產(chǎn)注冊復(fù)核檢驗和注冊審批費用：30萬元。（8）知識產(chǎn)權(quán)費用：5萬元。（9）其他費用：包括項目技術(shù)咨詢、成果鑒定、學(xué)術(shù)交流、會議、差旅費、勞務(wù)費、管理等費用50萬元。小計：1485萬元。1.2項目生產(chǎn)車間建設(shè)工程費用建設(shè)1000M2（1）土建工程費用：200萬元。（2）通風(fēng)、空調(diào)、消防、凈化安裝、裝修工程費用：500萬元。小計：700萬元。1.3項目生產(chǎn)設(shè)備、分析檢測儀器采購費用（1）生產(chǎn)設(shè)備采購費用①溶液配制系統(tǒng)3套：30萬元。②溶液過濾系統(tǒng)3套：90萬元。③溶液灌裝系統(tǒng)2套：60萬元。（2）分析檢測儀器采購費用①液相色譜儀1套：35萬元。②氣相色譜儀1套：50萬元。小計：265萬元。1.4藥品GMP認(rèn)證費用：10萬元。合計：2460萬元。2、科技經(jīng)費使用預(yù)算序號科目申報經(jīng)費1設(shè)備、儀器購置費202材料、樣品加工費503測試化驗加工費504資料、調(diào)研費55燃料動力費56技術(shù)合作與交流費1507出版/文獻/信息傳播/知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)費58專家咨詢費59鑒定或驗收費2010管理費1011其他合計320三、項目實施支撐條件（一）項目技術(shù)來源及知識產(chǎn)權(quán)情況本項目漢防己甲素制劑技術(shù)及其治療角膜病的用途均為自有技術(shù)，均具有自主知識產(chǎn)權(quán)（專利申請?zhí)枺?00910186826.0）。（二）項目實驗、檢測等外部配套條件1、已建有原料藥和制劑小試實驗室、中試工程技術(shù)研究中心。2、已建有制劑生產(chǎn)水、電、汽、環(huán)保、倉儲等輔助設(shè)施。3、已建有理化分析、光譜分析、色譜等分析檢測中心，配有紅外光譜、紫外-可見光譜等分析檢測儀器。（三）項目申請單位人才資源情況1、項目單位主要負責(zé)人朱丹基本情況朱丹，女，1952年7月21日出生，畢業(yè)于中國藥科大學(xué)，高級工程師。曾任解放軍186醫(yī)院藥劑科藥師、江西省藥品檢驗所主管藥師，制劑工藝和藥品質(zhì)量研究為其專長，并負責(zé)新藥藥代動力學(xué)和臨床研究。以朱丹為首的科研團隊通過不斷創(chuàng)新共獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的新藥30個，批準(zhǔn)進行臨床研究的新藥8個，已經(jīng)申請注冊和在研新藥12項；申請發(fā)明專利116項。榮獲南昌市五一勞動獎?wù)?、南昌市科技進步二等獎、江西省技術(shù)發(fā)明三等獎。2、項目主要負責(zé)人劉孝樂基本情況劉孝樂，男，1962年10月1日出生，大學(xué)學(xué)歷，藥學(xué)專業(yè)，高級工程師，是南昌弘益科技有限公司總經(jīng)理，國家創(chuàng)新型試點企業(yè)、國家知識產(chǎn)權(quán)試點企業(yè)、江西省創(chuàng)新型試點企業(yè)、江西省知識產(chǎn)權(quán)試點企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新負責(zé)人。劉孝樂同志近5年專業(yè)方面獲獎情況：（1）2005年被評為江西省科技創(chuàng)業(yè)十佳領(lǐng)軍人物。（2）2006年被評為南昌市十大杰出創(chuàng)新青年企業(yè)家。（3）2007年、2008年被評為南昌高新區(qū)創(chuàng)新先進個人。（4）2007年獲中國民營科技發(fā)展貢獻獎。（5）2007年南昌市科技進步二等獎項目負責(zé)人。（6）2008年江西省技術(shù)發(fā)明三等獎項目負責(zé)人。（7）2008年江西省優(yōu)秀科技新產(chǎn)品獎（6項）項目負責(zé)人。（8）2008年江西省優(yōu)秀新產(chǎn)品二等獎項目負責(zé)人。（9）2008年江西省優(yōu)秀新產(chǎn)品三等獎項目負責(zé)人。（10）2008年南昌市優(yōu)秀新產(chǎn)品二等獎項目負責(zé)人。（11）2008年南昌市優(yōu)秀新產(chǎn)品三等獎項目負責(zé)人。（12）2008年南昌市“521”（13）2008年享受南昌市政府特殊津貼。3、項目研發(fā)負責(zé)人高永良基本情況高永良，男，1951年出生，現(xiàn)任南昌弘益科技有限公司首席研發(fā)專家，畢業(yè)于中國藥科大學(xué)，曾任軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所制劑研究室主任，研究員（教授），博士生導(dǎo)師，主要研究領(lǐng)域為藥劑學(xué)。先后主持并完成了7個國家新藥品種研究，已獲新藥證書6個，申報發(fā)明專利18項，其中5項新藥成果和專利已轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，取得的經(jīng)濟效益逾48億人民幣。獲獎研究成果有六項。作為第一署名的獲軍隊科技進步二等獎3項和家科技進步三等獎1項；第二署名省科學(xué)技進步獎一等和二等獎各1項。已培養(yǎng)碩士研究生36名，博士研究生6名。擔(dān)任全國藥學(xué)會制劑專業(yè)委員會委員，國家、北京市、全軍新藥審評委員，全軍藥學(xué)會藥劑專業(yè)委員會主任委員，國家發(fā)改委藥品價格評審專家，國家863項目評審專家。1993年獲“全國首屆中國青年醫(yī)學(xué)科技之星”稱號。1994年享受國務(wù)院特殊津貼。1995年獲“吳階平—保羅楊森醫(yī)藥研究獎”制劑學(xué)科一等獎和光華科技基金三等獎，“2000年中國藥學(xué)發(fā)展獎”（藥劑學(xué)獎）獲得者。其事跡和突出貢獻，先后被人民日報、解放軍報、健康報、中央電視臺等新聞媒介報道。2009年被提名為中國工程院院士候選人。4、項目技術(shù)負責(zé)人錢進基本情況錢進，女，1948年6月26日出生，大學(xué)學(xué)歷，藥學(xué)專業(yè)，高級工程師，主持阿莫西林鈉與克拉維酸鉀復(fù)合制劑等20項新藥研究開發(fā)工作，并已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的新藥證書，取得了良好的社會效益和經(jīng)濟效益。獲得中國專利優(yōu)秀獎、江西省科學(xué)技術(shù)進步二等獎，江西省科技技術(shù)進步三等獎、江西優(yōu)秀重點新產(chǎn)品獎、江西省醫(yī)藥科技進步二等獎，江西技術(shù)發(fā)明三等獎、第十二屆上海經(jīng)濟區(qū)醫(yī)藥情報網(wǎng)年會三等獎。榮獲南昌市科技進步二等獎、江西省技術(shù)發(fā)明三等獎。5、項目申報單位技術(shù)人員總數(shù)、中高級技術(shù)人員比例項目申報單位南昌弘益科技有限公司現(xiàn)有員工136人，其中技術(shù)人員98人，占員工總數(shù)的72%；高級技術(shù)人員占員工總數(shù)的12%，中級技術(shù)人員占員工總數(shù)的23%。（四）項目組人員專業(yè)結(jié)構(gòu)、職稱結(jié)構(gòu)序號姓名性別出生日期職稱職務(wù)學(xué)歷專業(yè)1錢進女1948.6高級工程師總工程師大專藥學(xué)2高永良男1951.11研究員首席研發(fā)專家學(xué)士藥學(xué)3朱丹女1952.7高級工程師董事長學(xué)士藥學(xué)4劉孝樂男1962.10高級工程師課題總師大學(xué)藥學(xué)5穆正義男1953.6高級工程師技術(shù)總監(jiān)學(xué)士藥學(xué)6朱曉洪男1953.3主任藥師工程中心副主任學(xué)士藥學(xué)7李勁彤男1971.2研究員博士醫(yī)學(xué)8葉英女1964.11研究員首席科學(xué)家博士藥學(xué)9陶琳女1981.1工程師藥研所副所長學(xué)士藥學(xué)10趙銀鷹女1959.10高級工程師副總工程師學(xué)士藥學(xué)11蔣俊超男1986.10助理工程師學(xué)士藥學(xué)12黃國琴女1987.5技術(shù)員藥學(xué)13方丹丹女1986.7技術(shù)員藥學(xué)14章和清男1979.1助理工程師車間主任助理藥學(xué)15趙巖女1984.10助理工程師學(xué)士生物16章勇男1986.5技術(shù)員藥學(xué)（五）項目新增投資籌集情況項目新增投資2460萬元全部由項目申報單位自籌，其中申請銀行貸款1130萬元。四、項目預(yù)期經(jīng)濟效益（一）預(yù)期市場需求角膜病是我國的主要致盲眼病之一，但治療方法和藥物極其有限。本項目治療角膜病的漢防己甲素滴眼液具有顯著的療效和安全性，填補角膜病治療藥物市場空白，具有顯著的藥物經(jīng)濟學(xué)價值和經(jīng)濟社會效益。治療角膜病的漢防己甲素滴眼液作為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新藥物，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究和上市報道，亦未見相關(guān)專利報道，預(yù)計其年銷售峰值將達8億元。（二）預(yù)期盈利水平以下按年產(chǎn)銷500萬支漢防己甲素滴眼液分析經(jīng)濟效益（1）成本：每3.37元/支：①藥材、輔料費用：1.03元/支；②包裝材料費用：1.34元/支；③制造費用：每粒1.00元；（2）銷售價格：12元/支（3）稅金：1.54元/支①每支應(yīng)繳增值稅=[(12÷1.17)×17%]-[(1.03+1.34)÷1.17×17%=1.40元/支②每支應(yīng)繳附加稅=1.40×(7%+3%)=0.14元/支（4）項目達產(chǎn)時財務(wù)分析：①年銷售額=500萬支×12元/支=6000.00萬元②年銷售利潤=銷售額-成本-稅金=6000.00萬元-（3.37元×500）-(1.54元×500)=6000.00萬元-1685.00萬元-770.00萬元=3545.00萬元（5）三項費用（管理費用、銷售費用、財務(wù)費用）=6000.00×25%=1500.00萬元（6）凈利潤：3545.00-1500.00=2045.00萬元（7）投資利潤率=利潤÷投資額=2045.00÷2540.00=80.51%。（8）利稅率=利稅總額÷投資額=(2045.00+770.00)÷2540.00=110.82%（9）投資回收期(不含建設(shè)期)=投資額÷年現(xiàn)金凈流量=2540.00萬元÷2045.00萬元/年=1.24年（三）預(yù)期產(chǎn)業(yè)化前景1、漢防己甲素用于角膜病的機理研究為本項目奠定了基礎(chǔ)研究結(jié)果表明，漢防己甲素通過將細胞周期停滯在G0/G1期和誘導(dǎo)細胞凋亡而抑制角膜基質(zhì)細胞增殖，并能減少纖維連接蛋白在兔角膜基質(zhì)細胞間的堆積而發(fā)揮作用。體外動物實驗結(jié)果表明，漢防己甲素通過減少TGF-β1的表達和抑制NF-ΚB的活性以及減少細胞外基質(zhì)（ECM）的生成，對兔準(zhǔn)分子激光角膜屈光術(shù)（PPK）后角膜上皮下霧狀混濁（Haze）形成有明顯抑制作用。通過不同濃度漢防己甲素的對比研究，篩選出0.1%濃度漢防己甲素為最低有效濃度；同時，運用描