免疫化學(xué)技術(shù)

千里之行，始于足下朽木易折，金石可鏤Word-可編輯8免疫化學(xué)技術(shù)8.1免疫化學(xué)技術(shù)簡介現(xiàn)代免疫化學(xué)是研究抗原與抗體的組成、結(jié)構(gòu)以及抗原和抗體反應(yīng)的機(jī)制。此外，還研究體內(nèi)其他免疫活性物質(zhì)，如補(bǔ)體分子的組成、結(jié)構(gòu)及其功能。目前，免疫化學(xué)已應(yīng)用于免疫性疾病發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究和臨床檢測等。隨著免疫化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)也迅猛發(fā)展，并已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的重要手段，尤其是在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。免疫學(xué)檢測主意可分為體液免疫測定及細(xì)胞免疫測定。前者主要是按照抗原與相應(yīng)抗體能在體外發(fā)生特異性結(jié)合，并在一些輔助因子的參加下浮上沉淀、凝集及溶解等反應(yīng)，從而采用已知抗原檢測未知抗體，或用已知抗體檢測未知抗原。此外，尚包括檢測體液中各種可溶性免疫分子，諸如補(bǔ)體、各類免疫球蛋白、循環(huán)免疫復(fù)合物、溶菌酶、各種細(xì)胞因子等。細(xì)胞免疫測定則是按照各種免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、B細(xì)胞、K細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等）表面所具有的獨(dú)特標(biāo)志及其各自的異常功能，在體外（偶爾亦可在體內(nèi)）測定上述各種細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和功能，以協(xié)助了解機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。本章節(jié)僅限于推薦幾種主要的免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本原理及實(shí)驗(yàn)操作主意。8.2抗原的免疫原性和專一性抗原與免疫原：抗原（antigen,Ag）是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)使之產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物即抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，也稱為免疫原（immunogen）。前一種性能稱為免疫原性（immunogenicity）或抗原性（antigenicity），后一種性能稱為反應(yīng)原性（reactogenicity）或免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）?？乖姆诸悾喊凑湛乖镔|(zhì)所具備的性能可分為徹低抗原（completeantigen）和半抗原（hapten）兩類。同時具有免疫原性和免疫反應(yīng)性的抗原稱為徹低抗原，如細(xì)菌、病毒、異種動物血清等。僅具有與相應(yīng)抗原或致敏淋巴細(xì)胞結(jié)合的免疫反應(yīng)性，而無免疫原性的物質(zhì)稱為半抗原，如大多數(shù)的多糖、類脂及一些容易的化學(xué)物質(zhì)，它們本身不具免疫原性，但當(dāng)與蛋白質(zhì)大分子結(jié)合后形成復(fù)合物，便獲得了免疫原性，這種與半抗原結(jié)合并賦予它免疫原性的蛋白質(zhì)大分子稱為載體（carrier）。按照抗原的來源不同可分為外源性抗原與內(nèi)源性抗原。外源性抗原是從外界引入體內(nèi)而刺激機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答的。內(nèi)源性抗原是指體內(nèi)的自身成分，如機(jī)體的組織或細(xì)胞因理化因素作用或病毒感染使這些成分發(fā)生改變或修飾，成為一種自身抗原或稱新生抗原，使機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)。而按照抗原的化學(xué)組成可分成蛋白質(zhì)、糖類、脂類與核酸等抗原。構(gòu)成免疫原的條件：異物性是抗原物質(zhì)的首要性質(zhì)。免疫活性細(xì)胞在正常情況下具有高度確切的識別能力，能識別“自己”和“非己”，將非己物質(zhì)加以排斥。免疫應(yīng)答就其本質(zhì)來說，就是識別異物和排斥異物的應(yīng)答，故激發(fā)免疫應(yīng)答的抗原普通需要是異物，具有異物性的物質(zhì)可分為以下幾種：1）異種物質(zhì)：馬血清、異種蛋白質(zhì)、各種微生物及其代謝產(chǎn)物，對人來說是異種物質(zhì)，均為良好抗原。2）同種異體物質(zhì)：高等動物同種不同個體之間，因?yàn)檫z傳基因不同，其組織成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)也有差異。因此，同種異體物質(zhì)也可以是抗原物質(zhì)。例如人類紅細(xì)胞A、B、O血型物質(zhì)和人類白細(xì)胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA）即屬此類。3）自身抗原：自身組織成分通常無抗原性，但在某些異常情況下，自身成分也可成為抗原物質(zhì)?？乖胀榇蠓肿游镔|(zhì)，其分子量在10kD以上。在一定范圍內(nèi)，分子量越大，其抗原性越強(qiáng)。分子量在5kD以下的肽類，普通無抗原性，分子量為5－10kD的肽類為弱抗原?？乖毷谴蠓肿游镔|(zhì)的緣故為：1）分子量越大，表面的抗原決定簇越多，而淋巴細(xì)胞要求有一定數(shù)量的抗原決定簇的刺激才干活化。2）大分子膠體物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被破壞和清除，在體內(nèi)停歇時光較長，能持續(xù)刺激淋巴細(xì)胞。大分子物質(zhì)并不一定都有抗原性。例如明膠是蛋白質(zhì)，分子量達(dá)100kD以上，但其免疫原性很弱。因明膠所含成分為直鏈氨基酸，不穩(wěn)定，易在體內(nèi)水解成低分子化合物。如在明膠分子中參加少量酪氨酸則能增強(qiáng)其抗原性。因此，抗原物質(zhì)除應(yīng)為大分子外，其表面必須有一定的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)。此外，抗原分子的構(gòu)象（conformation）即抗原分子中一些異?；瘜W(xué)基因的三維結(jié)構(gòu)，它決定該抗原分子是否能與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面的抗原受體互相吻合，從而啟動免疫應(yīng)答。抗原分子的構(gòu)象變化，可導(dǎo)致其抗原性的改變?？乖奈锢硇誀钆c免疫原性的強(qiáng)弱有關(guān)。普通具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)其抗原性比直鏈分子強(qiáng)；聚合狀態(tài)的蛋白質(zhì)較其單體抗原性為強(qiáng)；顆粒性抗原較可溶性抗原為強(qiáng)。具備上述性狀的物質(zhì)須經(jīng)非消化道途徑進(jìn)入機(jī)體（包括注射、吸入、混入傷口等），并接觸免疫活性細(xì)胞，才干成為良好抗原。抗原特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)：抗原決定簇（antigenicdeterminant,AD）是存在于抗原表面的異?；鶊F(tuán)，又稱表位（epitope）?？乖ㄟ^抗原決定簇與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面抗原受體結(jié)合，從而激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答，抗原也藉此與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。因此，抗原決定簇是被免疫細(xì)胞識別的靶結(jié)構(gòu)，也是免疫反應(yīng)具有特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。一個抗原分子可具有一種或多種不同的抗原決定簇，每種決定簇惟獨(dú)一種抗原特異性?？乖瓫Q定簇的大小相當(dāng)于相應(yīng)抗體的抗原結(jié)合部位。普通蛋白質(zhì)的決定簇由5－6個氨基酸殘基組成，一個多糖決定簇由5－7個葡萄糖殘基組成，一個核酸半抗原的決定簇包含6－8個核苷酸?？乖Y(jié)合價（antigenicvalence）指能與抗體分子結(jié)合的決定簇的總數(shù)，包括抗原表面功能價及其內(nèi)部非功能價。8.3抗體的結(jié)構(gòu)和功能抗體是機(jī)體受抗原刺激后，由淋巴細(xì)胞異常是漿細(xì)胞合成的一類能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，因其具有免疫活性故又稱作免疫球蛋白（Immunoglobulin）。在免疫應(yīng)答過程中，抗體主要由分化的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，但偶爾也需要其他類型的細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的協(xié)同作用?？贵w主要分布在體內(nèi)血清中或外分泌液中，對體液免疫應(yīng)答起主要作用。目前已發(fā)現(xiàn)的人免疫球蛋白有五類，分離為IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。免疫球蛋白最顯著的特點(diǎn)是與抗原特異性結(jié)合以及其分子的不均一性。各種不同類別的免疫球蛋白分子都含有四條多肽鏈組成的基本結(jié)構(gòu)單位，即由兩條重鏈（heavychain,H鏈）和兩條輕鏈（lightchain,L鏈）通過不同數(shù)目的二硫鍵結(jié)成Y形（見圖8-1）。在抗體分子的N端，不同抗體分子的氨基酸組成和順序都是不同的，此區(qū)為“多變區(qū)”（variableregion,V區(qū)），它是抗體分子與抗原決定簇的結(jié)合部位。因?yàn)榭贵w多變區(qū)這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，決定了它對抗原分子“識別功能”的多樣性；不同抗體分子的C端結(jié)構(gòu)基本恒定，稱為“穩(wěn)定區(qū)”（constantregion,C區(qū)）。當(dāng)抗原與抗體結(jié)合時，抗體分子發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)和集聚作用，使穩(wěn)定區(qū)的某些部位裸露出來，并趕緊發(fā)生一系列免疫生理效應(yīng)，如固定補(bǔ)體，促進(jìn)對抗原分子的吞噬、溶解和清除作用。圖8-1IgG1的基本結(jié)構(gòu)Fig8-1.TheN-terminalendofIgG1ischaracterizedbysequencevariability(V)inboththeheavyandlightchains,referredtoastheVHandVLregionsrespectively.Therestofthemoleculehasarelativelyconstant(C)structure.TheconstantportionofthelightchainistermedtheCLregion.Theconstantportionoftheheavychainisfurtherdividedintothreestructurallydiscreteregions:CH1,CH2andCH3.Theseglobularregions,whicharestabilizedbyintrachaindisulphidebonds,arereferredtoas‘domains’.Thesitesatwhichtheantibodybindsantigenarelocatedinthevariabledomains.ThehingeregionisasegmentofheavychainbetweentheCH1andCH2domains.Flexibilityinthisareapermitsthetwoantigen-bindingsitestooperateindependently.ThereisclosepairingofthedomainsexceptintheCH2region.CarbohydratemoietiesareattachedtotheCH2domains.免疫球蛋白在血清自由電泳圖譜中主要分布在г－球蛋白區(qū)域，因此以前有人把г－球蛋白誤認(rèn)為就是抗體。其實(shí)г－球蛋白不全是抗體，而抗體也不全在г－球蛋白區(qū)域內(nèi)（見圖8-2）。圖8-2人血清免疫球蛋白的分布Fig8-2Electrophoresisofhumanserumshowingthedistributionofthefourmajorimmunoglobulinclasses.Serumproteinsareseparatedaccordingtotheirchargesinanelectricfield,andclassifiedas1,anddependingontheirmobility.(IgEclasshasasimilarmobilitytoIgDbutcannotberepresentedquantitativelybecauseofitslowlevelinserum).IgGexhibitsmostchargeheterogeneity,theotherclasseshavingamorerestrictedmobilityintheandfa88.4抗原抗體的結(jié)合體外抗原抗體反應(yīng)又稱血清學(xué)反應(yīng)（serologicreaction），因抗體主要存在于血清中，實(shí)驗(yàn)時普通都采用血清標(biāo)本，故名。但抗原抗體反應(yīng)亦常用于細(xì)胞免疫測定，如對淋巴細(xì)胞表面分化抗原的鑒定。因此，血清學(xué)一詞已被廣義的抗原抗體反應(yīng)所取代?？乖c抗體在體外結(jié)合時，可因抗原的物理性狀不同或參加反應(yīng)的成分不同而浮上各種反應(yīng)，例如凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合及中和反應(yīng)等。在此基礎(chǔ)上舉行改進(jìn)，又衍生出許多迅速而靈巧的抗原抗體反應(yīng)，例如從凝集反應(yīng)衍生出間接凝集、反向間接凝集、凝集抑制實(shí)驗(yàn)、協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)等；從沉淀反應(yīng)結(jié)合電泳，衍生出免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳等。此外，還有各種免疫標(biāo)記技術(shù)，如免疫熒光、酶免疫測定、發(fā)射免疫、免疫電鏡及發(fā)光免疫測定等?？乖贵w結(jié)合具有高度特異性，即一種抗原分子只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)?？乖奶禺愋匀Q于抗原決定簇的數(shù)目、性質(zhì)和空間構(gòu)型，而抗體的特異性則取決于抗體IgFab段的可變區(qū)與相應(yīng)抗原決定簇的結(jié)合能力?？乖c抗體不是通過共價鍵，而是通過很弱的短矩引力而結(jié)合，如范德華引力（Vanderwaal’sattractionforce）、靜電引力（electrostaticforce）、氫鍵（hydrogenbond）及疏水性作用（hydrophobiceffect）等。范德華引力與兩種互相作用的分子或原子間的距離七次方成反比（F2＝1/d7)，即兩者越逼近，此引力越大。這種引力能否最大限度地發(fā)揮作用，關(guān)鍵在于分子的空間構(gòu)型?？乖c抗體分子的互補(bǔ)空間關(guān)系有助于該引力發(fā)揮作用，它可增強(qiáng)兩種分子結(jié)合在一起的傾向，形成特異性抗原抗體復(fù)合物。若一個分子在形態(tài)上有一個凹陷，它能確切地與另一分子突出的基因互補(bǔ)，宛若抗原―抗體、酶―底物系統(tǒng)的活性部位的互相作用，這種互相作用可產(chǎn)生最強(qiáng)的VanderWaal接觸。靜電引力又稱庫侖引力（Coulumbicattractionforce）發(fā)生在帶有相反電荷的基團(tuán)之間，例如NH3＋與COO－之間。這種結(jié)合力的強(qiáng)度與兩個互相作用基團(tuán)間的距離平方成反比（F2＝1/d2)。若兩個分子間有可能發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移的部位，該部位也可能產(chǎn)生靜電引力。氫鍵可在共價鍵結(jié)合的氫原子間產(chǎn)生。氫原子可與一個帶負(fù)電荷的原子共價結(jié)合，再與另一個帶負(fù)電荷原子的非共價電子互相作用，就形成了氫鍵。例如：－O…H－O－－O…H－N－－N…H－N－氫鍵較弱，鍵能的大小取決于方向，即氫鍵具有方向性。在抗原抗體反應(yīng)中氨基或羧基是主要的供氫體，H＋必須直接對著或逼近帶負(fù)電荷的受體原子，才干產(chǎn)生強(qiáng)的氫鍵能，若間接對著，鍵能則異常小。氫鍵比VanderWaal引力更特異，因?yàn)樗枰肿由洗嬖诨パa(bǔ)的供氫體和受體基團(tuán)。疏水性結(jié)合或疏水作用在各種抗原抗體互相反應(yīng)中十分重要?？乖涂贵w分子上的疏水決定簇在水中不形成氫鍵，因此傾向于彼此間互相吸引，而不與水發(fā)生作用，故稱之為疏水性作用。疏水性作用雖不是引力，但它有助于抗原與抗體結(jié)合。例如含有苯基的抗原決定簇傾向于被其他非極性基團(tuán)圍繞，因此該抗原決定簇從水環(huán)境中移動進(jìn)入抗體分子的Fab段的裂縫中，與抗體結(jié)合。這說明結(jié)合的高能量歸因于苯基的疏水性作用。上述這些引力當(dāng)pH和離子強(qiáng)度在生理?xiàng)l件下，通常是最大的。pH值低于3～4或高于10.5，這些引力異常弱，以致抗原抗體復(fù)合物易解離?？乖c抗體結(jié)合有高度特異性，這種結(jié)合雖具有相當(dāng)穩(wěn)定性，但為可逆反應(yīng)。因抗原與抗體兩者為非共價鍵結(jié)合，宛若酶和底物的結(jié)合一樣，兩種分子間不形成穩(wěn)定的共價鍵，因此在一定條件下可以解離。圖8-3沉淀反應(yīng)Fig8-3Theclassicalillustrationoftheantigen-antibodyreactioninvitroistheprecipitinreaction.Asincreasingconcentrationsofantigenareaddedtoaconstantamountofantibody,theamountofimmunecomplexprecipitatedrisesandthenfalls.Theprecipitincurvegeneratedinthiswayhasthreezones:Antibodyexcesszone:theamountofantigenisinsufficienttoreactwithandprecipitatealltheantibodypresent;thusfreeantibodycanbedetectedinthesupernatant. Equivalencezone:theaddedantigenissufficienttocombinewithandprecipitatealltheantibodypresentandneitherfreeantigennorantibodycanbedetectedinthesupernatant. Antigenexcesszone:theamountofantigenexceedsthatrequiredtobindalltheantibody,andthisleadstoareductionintheamountofantibodyprecipitated.Thisfallisduetothesolubilizationoftheantigen-antibodycomplexesbytheexcessantigen.Theextenttowhichthisphenomenonoccursvarieswithdifferentantibodiesandwiththespeciesfromwhichtheantibodyisderived.抗原與抗體的結(jié)合，在一定濃度范圍內(nèi)，惟獨(dú)當(dāng)兩者分子比例合適時，才浮上可見反應(yīng)。以沉淀反應(yīng)為例，分子比例合適，沉淀物產(chǎn)生既快又多，體積大。分子比例不合適時，沉淀物產(chǎn)生少，體積小，或不產(chǎn)生沉淀物。對參加沉淀反應(yīng)的抗原―抗體系統(tǒng)可舉行定量測定，即將抗體置于一系列的試管中，參加不同量的相應(yīng)純抗原，混合后，看見所發(fā)生的反應(yīng)，對沉淀物可作精決定量。若抗體量固定不變，抗原量逐漸增強(qiáng)，可看見沉淀反應(yīng)中抗原、抗體分子的比例關(guān)系。由圖8-3可見有三個抗原抗體互相作用的區(qū)帶，1）抗體過剩區(qū)（antibodyexcesszone）：參加抗原量少，則沉淀物少，上清液中有游離的抗體（freeantibody）。2）平衡區(qū)（equivalencezone）：抗原量逐漸增強(qiáng)，沉淀物也逐漸增多，直到抗原、抗體比例最佳時，則浮上延續(xù)而穩(wěn)定的抗原―抗體晶格（lattice）沉淀，此時沉淀物中抗原抗體復(fù)合物量最多，上清中測不到游離的抗原（freeantigen）或抗體，此為平衡區(qū)或等價帶。3）抗原過剩區(qū)（antigenexcesszone）：抗原量繼續(xù)增強(qiáng)，所有抗體均與抗原結(jié)合，此時上清液中可測出游離的抗原，在此區(qū)帶中，因?yàn)榭乖^剩，則形成可溶性抗原抗體復(fù)合物，因而沉淀反應(yīng)部分或徹低被抑制?？贵w與抗原的結(jié)合是否浮上可見反應(yīng)，則與抗原抗體的膠體特性及極性基吸附作用有關(guān)?？贵w球蛋白和抗原（大多為蛋白質(zhì)、也有為多糖、類脂或其它化合物）在溶液中均屬于膠體物質(zhì)，帶有電荷。膠體粒子又有許多強(qiáng)極性基（如蛋白質(zhì)的羧基、氨基及肽鏈等），它們與水有很強(qiáng)的親和力，以致在粒子外周構(gòu)成水層，稱為親水膠體。膠體粒子不帶水層者，稱為疏水膠體。膠體粒子的穩(wěn)定性即依賴于所帶的水層及電荷，其中親水膠體的穩(wěn)定性較高。抗體和大多數(shù)抗原均屬于親水膠體。抗體球蛋白中的氨基酸在水溶液中發(fā)生電離，放出負(fù)電荷和正電荷。在一定的pH中，膠體粒子所帶的負(fù)電荷與正電荷相等，此稱為等電點(diǎn)（isoelectricpoint,pI）。當(dāng)溶液的pH大于其等電點(diǎn)，則羧基電離，膠體粒子帶負(fù)電荷。反之，當(dāng)溶液pH小于其等電點(diǎn)時，則氨基電離，膠體粒子帶正電荷。特異性抗體與相應(yīng)抗原間有相應(yīng)的極性基，它們互相吸引而結(jié)合。抗原抗體反應(yīng)普通分為兩個階段，第一階段為抗原和抗體的特異性結(jié)合，此階段需時很短，僅幾秒到幾分鐘，但無可見現(xiàn)象浮上。接著為第二階段，即可見反應(yīng)階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、細(xì)胞溶解等。此階段較長，歷時數(shù)分鐘、數(shù)小時以致數(shù)天。此階段反應(yīng)現(xiàn)象的浮上可受多種因素的影響?？乖c抗體普通為蛋白質(zhì)，它們在溶液中都具有膠體性質(zhì)，當(dāng)溶液的pH大于它們的等電點(diǎn)時，例如，在中性和弱堿性的水溶液中，它們大多表現(xiàn)為親水性，且?guī)в幸欢康呢?fù)電荷。特異性抗原和抗體有相對應(yīng)的極性基，抗原和抗體的特異性結(jié)合，也就是這些極性基的互相吸附。抗原和抗體結(jié)合后就由親水性變?yōu)槭杷?，此時易受電解質(zhì)影響。如有適當(dāng)濃度的電解質(zhì)存在，就會使它們失去一部分負(fù)電荷而互相凝結(jié)，于是浮上顯然的凝結(jié)或沉淀現(xiàn)象。若無電解質(zhì)存在，則不發(fā)生可見反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)，異常是第二階段受溫度的影響很大。在較高的溫度中，因?yàn)榭乖贵w復(fù)合物碰撞機(jī)會增多，復(fù)合物體積繼續(xù)增大的機(jī)會也多，故反應(yīng)現(xiàn)象加速浮上。但溫度過高（56℃以上），則抗原或抗體將變性或破壞。普通常置于37℃的恒溫水浴中，使反應(yīng)訊速浮上。合適的pH是抗原抗體反應(yīng)須要的條件之一。pH過高或過低可直接影響抗原和抗體的理化性質(zhì)。8.5動物的常規(guī)免疫因?yàn)閯游锏倪z傳性不同，同一抗原對不同的動物或同種不同品系動物，甚至不同個體，產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱是不同的。因此舉行動物免疫時，必須挑選對該抗原敏感的、衰老的健康動物。常用的實(shí)驗(yàn)動物有：馬、羊、兔、豚鼠和鼠等。當(dāng)抗原初次進(jìn)入具有免疫應(yīng)答能力的動物體內(nèi)后，經(jīng)過一段較長的埋伏期才浮上抗體，又經(jīng)過一段高峰期后，抗體量逐漸下降至出現(xiàn)。這段時期總的抗體量是較低的，主要的抗體成分是IgM，此為抗體對抗原的“初次應(yīng)答“。當(dāng)抗原再次進(jìn)入該機(jī)體時，血清中抗體很快浮上，含量和親和力也高于初次應(yīng)答，其抗體的主要成分是IgG，此為“再次應(yīng)答”。某些物質(zhì)若先于抗原或與抗原一起注入人體，可增強(qiáng)機(jī)體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型，此類物質(zhì)稱為免疫佐劑（immunoadjuvant），簡稱（adjuvant）。佐劑普通分為：1）無機(jī)佐劑，如氫氧化鋁，明礬等；2）有機(jī)佐劑，包括微生物及其代謝產(chǎn)物，如分枝桿菌（結(jié)核桿菌、卡介苗）、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌、革蘭氏陰性桿菌的內(nèi)毒素等；3）合成佐劑，包括人工合成的雙鏈多聚核苷酸，如雙鏈多聚肌苷酸、胞苷酸（polyI:C）、雙鏈多聚腺苷酸、尿苷酸（polyA:U）等；4）油劑，如弗氏佐劑、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等。弗氏佐劑是目前在動物實(shí)驗(yàn)中最常用的佐劑，可分為弗氏不徹低佐劑（incompleteFreund’sadjuvant,IFA）和弗氏徹低佐劑（completeFreund’sadjuvant,CFA）兩種。前者是將抗原和油劑（石蠟油或花生油）混合，再參加乳化劑（羊毛脂或吐溫－80），使成為油包水乳劑，即為IFA。在IFA中參加死的分枝桿菌（如滅活結(jié)核桿菌）就成為CFA。CFA作用較弱，但易在注射部位形成肉芽腫和持久性潰瘍，因而不適于人體使用。佐劑的生物學(xué)作用為：1）增強(qiáng)免疫原性，使無或微弱免疫原性的物質(zhì)變成有效的免疫原；2）可提高初次應(yīng)答和再次應(yīng)答的抗體滴度；3）改變抗體類型，使由產(chǎn)生IgM改變?yōu)楫a(chǎn)生IgG；4）引起或增強(qiáng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。動物個體的不同組織部位對抗原刺激的敏感性也是不同的。淋巴結(jié)、脾臟、足掌、眼睫膜等是反應(yīng)的敏感部位，也是免疫動物的常用部位。異體蛋白在佐劑參加下，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，獲得相應(yīng)的抗體。倘若抗原的免疫原性很強(qiáng)，在基礎(chǔ)免疫（第一次免疫）之后，加強(qiáng)免疫3～4次，便可獲得較高效價的抗血清（antiserum）。8.6雙向免疫蔓延及免疫電泳將可溶性抗原（如小牛血清）與相應(yīng)抗體（如兔抗小牛血清的抗體）混合，當(dāng)兩者比例合適并有電解質(zhì)（如氯化鈉、磷酸鹽等）存在時，即有抗原―抗體復(fù)合物的沉淀浮上，此為沉淀反應(yīng)（precipitinreaction）。如以瓊脂凝膠為支持介質(zhì)，則在凝膠中浮上可見的沉淀線、沉淀弧或沉淀峰。按照沉淀浮上與否及沉淀量的多寡，可定性、定量地檢測出樣品中抗原或抗體的存在及含量。免疫學(xué)的一些測定主意即基于此特性。雙向蔓延法（doublediffusion），最早由Ouchterlony創(chuàng)立，故又稱Ouchterlony法。此法是利用瓊脂凝膠為介質(zhì)的一種沉淀反應(yīng)。瓊脂凝膠是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大分子物質(zhì)可以自由通過，這種分子的蔓延作用使分離兩處的抗原和相應(yīng)抗體相遇，形成抗原―抗體復(fù)合物，比例合適時浮上沉淀。因?yàn)槟z透明度高，可直接看見到復(fù)合物的沉淀線（?。?。沉淀線（弧）的特征與位置取決于抗原相對分子質(zhì)量的大小、分子結(jié)構(gòu)、蔓延系數(shù)和濃度等因素。當(dāng)抗原、抗體存在多種系統(tǒng)時，會浮上多條沉淀線（弧）。根據(jù)沉淀線（?。┛梢远ㄐ钥乖４朔ú僮骱啽?、靈巧度高，是最為常用的免疫學(xué)測定抗原和測定抗血清效價的主意（見圖8-4）。圖8-4免疫雙向蔓延法Fig8-4Inimmuno-double-diffusion,agargelsarepouredontoslidesandallowedtoset,wellsarethenpunchedinthegelandthetestsolutionsofantigen(Ag)andantibody(Ab)areadded.ThesolutionsdiffuseoutandwhereAgandAbmeettheybindtoeachother,cross-linkandprecipitateleavingalineofprecipitation.Thistechniquemaybeusedtodeterminetherelationshipbetweenantigensandaparticulartestantibody.Threebasicpatternsappear.Inreaction(a)theprecipitinarcsformedbetweentheantibodyandthetwotestantigenfuse,indicatingthattheantibodyisprecipitatingidenticalepitopesineachpreparation(epitope1).Thisdoesnotmeanthattheantigensarenecessarilyidentical,theyareonlyidenticalinasfarastheantibodycannotdistinguishadifference.Inreaction(b)theantibodypreparationdistinguishesthethreedifferentantigens,whichformindependentprecipitinarcs.Inreaction(c)theantigensshareepitope1butoneantigenalsohasepitope2.Thisisthesamesituationasin(a),butinthiscasetheantibodycandistinguishthem,byvirtueofbeingabletoreactagainstbothepitopes.Alineofidentityformswithanti-epitope1,withtheadditionofa‘spur’wheretheanti-epitope2hasreactedwiththesecondepitope,thusindicatingpartialratherthantotalidentitybetweentheantigenpreparations.圖8-5免疫電泳法Fig8-5Immunoelectrophoresisallowsthecomparisonofcomplicatedmixturesofantigensuchasarefoundinserum.1.Antigensareseparatedinanagargelbyplacinganelectricchargeacrossit.Thegel’spHischosensothatpositivelychargedproteinsmovetothenegativeelectrodeandnegativelychargedproteinstothepositive.2.Atroughisthencutbetweenthewellsandfiledwiththeantibody,whichislefttodiffuse.3.Theantigensandantibodyformprecipitinarcs.免疫電泳法（immunoelectrophoresis）（見圖8-5）是在凝膠介質(zhì)中將電泳法與蔓延法相結(jié)合的一種免疫化學(xué)主意，用以研究抗原和抗體。免疫電泳是使血清在瓊脂或瓊脂糖中舉行的電泳。在一定電場強(qiáng)度下，因?yàn)檠逯懈鞣N免疫球蛋白的分子大小以及荷電狀態(tài)和荷電量均有差異，因而它們的泳動速率也各不相同，加上電泳過程中電滲作用的影響，使各自組分得到分離。在一定電場強(qiáng)度下，抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中加速蔓延相遇而形成復(fù)合物沉淀，這種檢測主意稱作電免疫蔓延法（electroimmunodiffusion）。因?yàn)椴僮髦饕獠煌?，電免疫蔓延法可分為對流免疫電泳（countercurrentimmunoelectrophoresis）（見圖8-6），交錯免疫電泳（crossedimmunoelectrophoresis）和火箭免疫電泳（rocketimmunoelectrophoresis）（見圖8-7）。圖8-6（上圖）對流免疫蔓延法圖8-7（下圖）火箭免疫電泳法Fig8-6,8-7CountercurrentelectrophoresisisperformedinagargelswherethepHischosensothattheantibodyispositivelychargedandtheantigenbeingtestedisnegativelycharged.Byapplyingavoltageacrossthegeltheantigenandantibodymovetowardseachotherandprecipitate.Theprincipleisthesameasforimmuno-double-diffusionbutthesensitivityisincreased10-20fold.Antigensmaybequantitatedbyelectrophoresingthemintoanantibody-containinggelinthetechniquetermedrocketelectrophoresis.ThepHofthegelischosensothattheantibodiesareimmobileandtheantigenisnegativelycharged.Precipitinrocketsform;theheightoftherocketisproportionaltoantigenconcentration,andunknownsaredeterminedbyinterpolationfromstandards.Theappearanceofstainedrocketsisshownantheright.BothtechniquesrelyontheantigenandantibodyhavingdifferentchargesattheselectedpH;thisistrueformostantigenssinceantibodieshavearelativelyhighisoelectricpoint(i.e.theyareneutrallychargedatamorealkalinepHthanmostantigens).Ifthechargesontheantigenandantibodydonotdiffersufficiently,theantibodyorantigencanbechemicallymodifiedtoalteritsisoelectricpoint.RocketelectrophoresiscanbereversedtoestimateantibodyconcentrationifasuitablepHgelcanbefoundtoimmobilizetheantigen,withoutdamagingitorpreventingtheantigen-antibodyreaction.8.7酶聯(lián)免疫吸附法酶免疫測定（enzymeimmunoassay,EIA）或免疫酶技術(shù)（immunoenzymatictechnique）是指用酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗體舉行的抗原抗體反應(yīng)。它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)與酶銜接，然后通過酶與底物產(chǎn)生色彩反應(yīng)，用于定量測定。目前常用的主意稱為酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA），其主意容易，方便訊速，特異性強(qiáng)。ELISA是由抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈色彩。其所生成的色彩深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比（見圖8-8）。圖8-8酶聯(lián)免疫吸附法Fig8-8ELISA.1.Antigeninsalineisincubatedonaplasticplateortube,andsmallquantitiesbecomeabsorbedontotheplasticsurface.2.Freeantigeniswashedaway.(Theplatemaythenbeblockedwithexcessofanirrelevantproteintopreventanysubsequentnon-specificbindingofproteins).3.Testantibodyisadded,whichbindstotheantigen.4.Unboundproteinsarewashedaway.5.Theantibodyisdetectedbyaligand.Theligandisamoleculewhichcandetecttheantibodyandiscovalentlycoupledtoanenzymesuchasperoxidase.6.Thisbindsthetestantibodyandafterfreeligandiswashedaway.7.Theboundligandisvisualizedbytheadditionofchromogen-acolourlesssubstratewhichisactedonbytheenzymeportionoftheligandtoproduceacolouredend-product.8.Adevelopedplateisshowninthelowerpanel.Theamountoftestantibodyismeasuredbyassessingtheamountofcolouredend-productbyopticaldensityscanningoftheplate.酶免疫測定技術(shù)還包括生物素―親和素系統(tǒng)（biotin-avidinsystem,BAS），均相酶免疫測定法（homogeneousenzymeimmunoassay,HEI）等。免疫標(biāo)記技術(shù)中還有免疫熒光技術(shù)（immunofluorescencetechnique），發(fā)射免疫測定（radioimmunoassay,RIA）和發(fā)光免疫測定（luminescentimmunoassay,LIA）等。此外，免疫印跡或免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)（immunoblotting或Westernblot）已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成為免疫學(xué)、微生物學(xué)及其它生命科學(xué)常用的一種重要研究主意。實(shí)際上它是由十二烷基磺酸鈉―聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印和固相免疫測定三項(xiàng)技術(shù)結(jié)合而成。其基本原理是蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過SDS－PAGE分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳或直接印漬方式原位轉(zhuǎn)印至固相介質(zhì)上，并保持其原有的物質(zhì)類型和生物學(xué)活性不變，然后應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)舉行特異性檢測。因?yàn)榇思夹g(shù)具有SDS－PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高度特異性和敏感性，主意簡便，標(biāo)本可持久保存，便于比較（見圖8-9）。圖8-9免疫印跡Fig8-9Inimmunoblotting,antigensamplesarefirstseparatedinananalyticalgel,forexampleanSDS.Theresolvedmoleculesaretransferredelectrophoreticallytoanitrocellulosemembraneinablottingtank.Theblotisthentreatedwithantibodytothespecificantigen,washed,andaradiolabelledconjugatetodetectantibodiesisboundtotheblot.TheprincipleissimilartothatofaRIAorELISA.Afterwashingagain,theblotisplacedincontactwithX-rayfilminacassette;theautoradiographisdevelopedandtheantigenbandswhichhaveboundtheantibodyarevisible.Thetechniquecanbemodifiedforusewithachemiluminescentlabeloranenzyme-coupledconjugate(asinELISA),wheretheboundmaterialcanbedetectedbytreatmentwithachromogenwhichdeposits