黃曲霉毒素M1檢測試劑

1、黃曲霉毒素M1檢測試劑Aflatoxin M1RIDASCREEN® Aflatoxin M1簡介RIDASCREEN® Aflatoxin M1 30/15產(chǎn)品編號: (R1111)采用競爭酶標(biāo)免疫法定量檢測牛奶、奶粉和奶酪中的黃曲霉毒素M1。試劑盒中包括了所有檢測用的試劑。該試劑盒有96個(gè)試驗(yàn)孔（包括標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)）如果進(jìn)行定量分析，必須有微孔板酶標(biāo)儀。（中文翻譯件僅供參考，以試劑盒內(nèi)附的英文原件為準(zhǔn)）樣品制備牛奶：脫脂奶粉：還原、脫脂奶酪：提取、離心時(shí)間要求：（以10個(gè)樣品為例）牛奶/奶粉.奶酪.大約2小時(shí)孵育時(shí)間時(shí)間.大約1小時(shí)檢測下限牛奶/奶粉：5ppt奶酪：50ppt

2、回收率牛奶：大約95奶粉：大約95奶酪：大約102交叉反應(yīng)黃曲霉毒素M1.100黃曲霉毒素M2.301. 產(chǎn)品用途RIDASCREEN® Aflatoxin M1 30/15試劑盒利用競爭性酶免疫分析方法，用于定量檢測牛奶、奶粉和奶酪中的黃曲霉毒素M1。2. 概述黃曲霉毒素是Aspergillus flavus 和 Aspergillus parasiticus等霉菌的代謝產(chǎn)物，能致癌，高毒。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1的代謝產(chǎn)物。經(jīng)攝入含有黃曲霉毒素B1飼料的奶牛產(chǎn)出的牛奶中，其中便含有黃曲霉毒素M1。由于黃曲霉毒素M1相當(dāng)穩(wěn)定，巴氏滅菌法也無法將其殺滅，所以檢測黃曲霉毒素M1不

3、僅要在飼料原料中檢測，而且在最終產(chǎn)品中也需要進(jìn)行鑒定。自1999年一月開始，歐盟就制定了黃曲霉毒素殘留的檢測限，黃曲霉毒素M1的檢測限為0.05 g/l (50 ppt)。使用RIDASCREEN® Aflatoxin M1 30/15可以精確定量檢測牛奶、奶粉和奶酪中的黃曲霉毒素M1。3. 測定原理測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板包被有針對黃曲霉毒素M1的特異性抗體。加入標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液和在洗板后加入黃曲霉毒素酶標(biāo)記物，游離黃曲霉毒素M1與黃曲霉毒素M1酶標(biāo)記物競爭結(jié)合黃曲霉毒素M1抗體的結(jié)合位點(diǎn)（競爭性酶免疫分析方法）。沒有連接的酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。加入底物/發(fā)色劑到孔中并

4、且孵育。結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色產(chǎn)生由藍(lán)色變成黃色。在450nm處測量，吸光值與樣品中黃曲霉毒素M1濃度成反比。4 提供的試劑每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)測量（包括標(biāo)準(zhǔn)測定孔）盒中的材料如下：1×96孔板（12條 X 8孔）包被有黃曲霉毒素M1抗體6×黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)液，1.3 ml/瓶濃度為：0 ppt， 5 ppt，10 ppt，20 ppt，40 ppt，80 ppt黃曲霉毒素M1的牛奶緩沖液1×ml）.紅色帽過氧化物酶標(biāo)記物的黃曲霉毒素M11×底物/發(fā)色劑（12ml）. 棕色色帽微紅色，包含四甲基苯

5、醌1×反應(yīng)停止液（14ml）. 黃色帽為1N硫酸1×緩沖液1（20ml）樣品稀釋緩沖液1×緩沖液2（12ml）. .白色帽酶標(biāo)記物稀釋緩沖液1×洗滌緩沖液為10Mm的磷酸緩沖液（pH7.4），包含0.05%的Tween205. 需要的材料但盒中不提供-微孔板酶標(biāo)儀(450nm)-離心機(jī)-巴氏吸液管-刻度吸量管-50ul，100ul，400ul微量加樣器-只用于奶酪檢測-振蕩器-蒸發(fā)器5.2 試劑-甲醇-n-庚烷-二氯甲烷-PBS-緩沖液，：0.55g NaH2PO4 x H2O+ 2.85g Na2HPO4 x 2H2O +9gNaCl , 加入蒸餾水至

6、1000ml6. 操作者應(yīng)該注意之事項(xiàng)-標(biāo)準(zhǔn)液含有黃曲霉毒素M1（致癌），要特別小心，應(yīng)戴手套，避免試劑接觸皮膚-使用過的玻璃容器最好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡過夜-反應(yīng)停止液為1N硫酸，避免接觸皮膚-不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度的降低-不要交換使用不同批號的盒中試劑7. 儲存條件-保存試劑盒于2-80C。不要冷凍-將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下-無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下8 試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑若顯色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.6個(gè)

7、單位 (A450nm<0.6)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。9 樣品處理9.1. 牛奶-取牛奶樣品，用冷凍離心機(jī)（3500g ，10）離心10分鐘去除脂肪（如沒有冷凍離心機(jī)，可將樣品先冷卻到10，再離心）-離心后用巴氏吸液管徹底去除上層奶油。-取脫脂牛奶用于檢測（每孔100l）9.2. 奶粉-用天平稱取10g奶粉到容量瓶加去離子水到100ml。（還原牛奶）-震蕩5分鐘，使充分溶解。-按照牛奶樣品處理步驟進(jìn)行9.3. 奶酪代表性的樣品應(yīng)該研磨，充分混合。整個(gè)均質(zhì)過程不要加入任何液體。如果奶酪表面呈現(xiàn)出不同狀態(tài)，則不要取奶酪表面作為樣品，否則將影響檢測結(jié)果。-稱取2 g研磨過的奶酪，裝入玻璃離心管中

8、。-加入40ml二氯甲烷，放在振蕩器上震蕩15分鐘。-過濾后取10ml濾液60 °C氮?dú)獯蹈?將吹干殘留的油狀物用0.5 ml甲醇、0.5 ml PBS緩沖液（參見5.2.）和1 ml庚烷充分混合溶解。-離心: 15分鐘 / 2700 g / 15 °C -完全除去上層庚烷層。-用巴氏移液管小心移取部分甲醇水層-取100 l甲醇水層用400 l緩沖液1稀釋成為含10%甲醇的溶液-每孔用100 l進(jìn)行檢測。 備注:如果需要進(jìn)一步稀釋溶液，則使用緩沖液1進(jìn)行稀釋。10. 酶標(biāo)免疫分析程序1. 用之前將所有試劑回升至室溫（20-25）。2. 使用之后立即將所有試劑放回2-8。 3

9、. 在使用中不要讓微孔干燥。4. 在EIA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是EIA測定程序中的要點(diǎn)。5. 在所有孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。10.2 黃曲霉毒素M1酶標(biāo)記物Aflatoxin M1 酶標(biāo)記物（紅帽）為濃縮液。由于稀釋了的酶標(biāo)記物穩(wěn)定性不好，因此只稀釋需用量的酶標(biāo)記物。稀釋前酶標(biāo)記物應(yīng)輕輕振蕩混勻。酶標(biāo)記物用緩沖液2（白帽）以1: 11的比例稀釋(400 l濃縮液+ 4.0 ml 緩沖液，足夠4個(gè)微孔板條32孔檢測)10.3 洗滌緩沖液在試劑盒中提供一包洗滌緩沖液的粉劑，一包粉劑溶解于1升的蒸餾水中，制備好的洗滌緩沖液在4o

10、C條件下可以保存4周。10.4 包被有抗體的微孔板條錫箔袋沿橫向邊壓封線外側(cè)剪開。取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-80C。不要冷凍。10.5 測定程序 （在20-25 oC條件下操作）1將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)及樣品做平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)及樣品的位置。2. 加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，輕輕震板混合，在室溫（20-25 oC）暗處孵育30分鐘。3倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中液體。每孔注入250ul洗滌緩沖液（見10.3）再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體，

11、重復(fù)操作洗滌步驟兩次以上。4加入100ul酶標(biāo)記物（紅色帽）到微孔底部，輕輕震板混合，在室溫（20-25 oC）暗處孵育15分鐘。5倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中液體。每孔注入250ul洗滌緩沖液（見10.3）再次倒出孔中的液體，完全除去孔中的液體，重復(fù)操作洗滌步驟兩次以上。6加入100ul底物/發(fā)色劑到微孔中，混合后在室溫（20-25 oC）暗處孵育15分鐘。7加入100ul反應(yīng)停止液到微孔中，混合好在450nm處測量吸光度值，以空氣為空白，15分鐘內(nèi)讀取光度值。11. 結(jié)果所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn) （0標(biāo)準(zhǔn)） 的吸光度值再乘以100。因

12、此0標(biāo)準(zhǔn)等于100%并且以百分比給出吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值（或樣品） × 100= %吸光度值0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)值繪成為一個(gè)以黃曲霉毒素M1濃度（ng/l）的半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在10-40 ng/l （ppt）范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性，相對應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。為了得到樣品中黃曲霉毒素M1的含量（ng/l），在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的濃度必須乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。樣品的稀釋倍數(shù)如下：牛奶.1奶粉/奶酪. 10R-Biopharm開發(fā)出用于計(jì)算ELISA試劑盒檢測結(jié)果的專用軟件RIDA® SOFT，可以向當(dāng)?shù)胤咒N商索取該軟件。12 靈敏度RIDASCREEN® Aflatoxin M1 30/15試劑盒的最低檢測下限為大約5 ppt，按照樣品處理記錄，牛奶、奶粉的檢測限為5 ppt，奶酪的檢測限為5 0ppt。13 特異性RIDASCREEN®黃曲霉毒素M1 30/15試劑盒的特異性通過對相應(yīng)的霉菌毒素交叉反應(yīng)性分析而得到：交叉反應(yīng)：黃曲霉毒素M1. 100 %黃曲霉毒素M2. 30 %14 再