AbMole局部氫氣釋放重塑衰老微環(huán)境促進(jìn)受傷骨骼修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

AbMole|局部氫氣釋放重塑衰老微環(huán)境促進(jìn)受傷骨骼修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究隨著人口老齡化的加劇，衰老相關(guān)疾病的治療成為了醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。骨骼衰老和損傷后的修復(fù)困難是老年人面臨的重要問(wèn)題之一。來(lái)自中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院神經(jīng)工程研究中心的ShengqiangChen,YuanmanYu,SongqingXie等多名研究人員發(fā)表了題為《LocalH2releaseremodelssenescencemicroenvironmentforimprovedrepairofinjuredbone》的研究成果，文章探討局部氫氣（H?）釋放對(duì)衰老骨骼微環(huán)境的重塑作用及其對(duì)受傷骨骼修復(fù)的影響。在該文章中，研究人員使用了購(gòu)自AbMole的ruxolitinib（目錄號(hào)M1787）、quercetin（目錄號(hào)M3902）、dasatinib（M1701）。細(xì)胞分離與培養(yǎng)：從24個(gè)月大的衰老小鼠（相當(dāng)于70歲的人）的骨骼中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）、巨噬細(xì)胞和骨細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定和培養(yǎng)。持續(xù)H?供應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)：將分離出的細(xì)胞在60%氫氣培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育7天，模擬體外持續(xù)H?供應(yīng)微環(huán)境，檢測(cè)代表性衰老生物標(biāo)志物（ROS、HO-1、p16、p21、Ki67、γ-H2A.X、TAFs、SA-β-gal、IL-6和IL-1β）的表達(dá)，評(píng)估H?對(duì)細(xì)胞衰老和炎癥的影響。圖1：可持續(xù)H的體外抗炎和抗衰老行為2治療衰老骨骼中的各種衰老細(xì)胞。持續(xù)H?釋放支架的構(gòu)建與表征：合成聚羥基鏈烷酸酯（PHA）包裹的CaSi?納米顆粒（CSN），并將其負(fù)載到介孔生物活性玻璃（MBG）支架上（CSN@PHA-MBG），通過(guò)電噴霧法制備出具有高H?負(fù)載和持續(xù)H?釋放能力的支架。圖2：CSN和CSN@PHA-MBG支架的結(jié)構(gòu)和氫釋放行為。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：建立老年小鼠（24個(gè)月大）臨界尺寸股骨塞缺損模型（直徑1.2mm的圓形缺損），評(píng)估CSN@PHA-MBG支架在體內(nèi)的氫釋放行為、對(duì)局部炎癥的影響以及對(duì)衰老和免疫調(diào)節(jié)的作用?？寡装Y和抗衰老作用：與從年輕骨骼中采集的細(xì)胞相比，衰老骨骼中的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的衰老特征，包括細(xì)胞內(nèi)ROS、p16、p21和SA-β-gal的過(guò)度表達(dá)，以及HO-1和Ki67的低表達(dá)。γ-H2A.X焦點(diǎn)與TAFs共定位。連續(xù)7天的H?處理顯著下調(diào)了所有這些衰老生物標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了HO-1活性和Ki67表達(dá)，表明H?具有強(qiáng)大的普遍抗衰作用。對(duì)SASP成分的影響：H?降低了所有研究類型細(xì)胞中IL-6和IL-1β的水平，特別是在第3天和第7天顯著下調(diào)了IL-6的表達(dá)，在BMSCs和巨噬細(xì)胞中顯著降低了IL-1β的表達(dá)。圖3：支架處理7天后衰老骨缺損部位的SASP成分分析。對(duì)巨噬細(xì)胞極化的作用：H?在7天的處理過(guò)程中將巨噬細(xì)胞從M1表型（CD86和iNOS）極化為M2表型（CD206、Arg1和Il-10），TNF-α水平與TGF-β1水平的比值顯著下降，表明H?誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞從促炎亞型向抗炎亞型的轉(zhuǎn)變。對(duì)BMSCs再生潛力的影響：H?處理顯著阻止了BMSCs衰老的進(jìn)展，減少了SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，降低了衰老相關(guān)基因（p16、p21和p53）的表達(dá)，同時(shí)抑制了衰老細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞生成的影響，保存了BMSCs的成骨分化潛力，表現(xiàn)為成骨相關(guān)基因（Runx2、Osterix、Alp、Opn、Col.I和Ocn）的表達(dá)增強(qiáng)和礦化程度的提高。圖4：CSN@PHA-MBG支架對(duì)受傷衰老骨骼中BMSC募集和衰老的影響。CSN的合成與表征：通過(guò)微波輔助化學(xué)剝離法合成了CSN，其尺寸約為500nm，化學(xué)剝離未改變CaSi?的化學(xué)組成和晶體結(jié)構(gòu)，CSN在pH=7.4的PBS中能水解釋放大量H?，但會(huì)在一天內(nèi)完全降解。CSN@PHA-MBG支架的制備與表征：通過(guò)將PHA包裹的CSN沉積在MBG底物的多孔表面上，制備出CSN@PHA-MBG支架。該支架具有持續(xù)的H?釋放特性，釋放時(shí)間長(zhǎng)達(dá)7天，且具有高細(xì)胞相容性。CSN@PHA-MBG支架能顯著降低BMSCs中SA-β-gal的表達(dá)，其最低有效CSN含量（或氫劑量）約為70μg/g。局部持續(xù)氫釋放對(duì)衰老骨骼微環(huán)境和巨噬細(xì)胞極化的影響：CSN@PHA-MBG支架在體內(nèi)的氫釋放時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9天，比在PBS中更長(zhǎng)。在植入后的第3天和第7天，植入部位出現(xiàn)了強(qiáng)烈的綠色熒光（F4/80標(biāo)記的巨噬細(xì)胞），表明存在炎癥現(xiàn)象。與對(duì)照組和PHA-MBG載體組相比，CSN@PHA-MBG支架具有強(qiáng)大的抗炎作用，表現(xiàn)為iNOS表達(dá)降低（M1巨噬細(xì)胞表型的生物標(biāo)志物）、ARG1水平升高（M2巨噬細(xì)胞表型的生物標(biāo)志物）和纖維化減少。p16陽(yáng)性細(xì)胞的比例隨著時(shí)間的推移而增加，顯示出衰老的旁觀者效應(yīng)，但CSN@PHA-MBG顯著且穩(wěn)定地減輕了衰老/損傷疊加衰老的進(jìn)展。巨噬細(xì)胞中p16陽(yáng)性表型較高，H?持續(xù)釋放至7天在防止巨噬細(xì)胞衰老和介導(dǎo)免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。CSN@PHA-MBG更顯著且穩(wěn)定地降低了M1表型和M2表型巨噬細(xì)胞數(shù)量的比例，在第7天誘導(dǎo)了高比例的M2表型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（約40%），表明微環(huán)境從促炎向抗炎的有效轉(zhuǎn)變，有利于衰老骨骼微環(huán)境的重塑和損傷修復(fù)。氫釋放支架對(duì)衰老骨骼缺損部位促再生微環(huán)境的影響：與對(duì)照組和PHA-MBG組相比，CSN@PHA-MBG組中富集的BMSCs比例更高，p16表達(dá)顯著降低，衰老BMSCs的比例最低。同時(shí)，CSN@PHA-MBG支架顯著增加了骨祖細(xì)胞和H型內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)了血管網(wǎng)絡(luò)的形成，為BMSCs的招募和抗衰提供了有利的生態(tài)位，支持血管生成和骨生成，促進(jìn)衰老骨骼缺損的再生。氫釋放支架對(duì)受傷衰老骨骼修復(fù)結(jié)果的影響：通過(guò)對(duì)新形成組織的骨形成率、組織形態(tài)、衰老細(xì)胞負(fù)擔(dān)和抗破骨細(xì)胞生成潛力的綜合分析，發(fā)現(xiàn)CSN@PHA-MBG支架顯著增強(qiáng)了骨沉積速率，組織學(xué)檢查顯示出更快的骨形成和更多的新骨生成。在治療結(jié)束時(shí)（第28天），CSN@PHA-MBG組的骨體積/總體積比（BV/TV）更高，骨小梁數(shù)量（Tb.N）更多，骨小梁厚度（Tb.Th）更大，且衰老細(xì)胞（p16?）明顯減少，抗破骨細(xì)胞生成作用明顯，Vpp3表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞減少。這些結(jié)果表明，CSN@PHA-MBG支架通過(guò)有效的微環(huán)境重塑，在抑制破骨細(xì)胞生成方面發(fā)揮了主要作用，從而改善了衰老骨骼缺損的修復(fù)結(jié)果。本文揭示了局部H?釋放通過(guò)衰老巨噬細(xì)胞的復(fù)極化和分泌組變化改變微環(huán)境，從促炎轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡?，減輕衰老/損傷疊加衰老的進(jìn)展，促進(jìn)內(nèi)