THBIQA 0003.1-2024 食品中常見(jiàn)高組胺魚(yú)源性成分檢測(cè)方法 第1部分：藍(lán)圓修實(shí)時(shí)熒光PCR法

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T/HBIQAT/HBIQA0003.1—2024食品中常見(jiàn)高組胺魚(yú)源性成分檢測(cè)方法1PCRDetectionofcommonHistamine-richfishderivedingredientinfoodPart1:DecapterusmaruadsiReal-timePCRmethod2024-08-15發(fā)布 2024-10-15實(shí)施河北省檢驗(yàn)檢疫學(xué)會(huì)發(fā)布T/HBIQA0003.1—2024T/HBIQA0003.1—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。T/HBIQA0003-2024《食品中常見(jiàn)高組胺魚(yú)源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法系列標(biāo)準(zhǔn)》分為7個(gè)部分：1PCR2PCR3PCR4PCR5PCR6PCR法第7部分：藍(lán)點(diǎn)馬鮫實(shí)時(shí)熒光PCR法T/HBIQA0003.1-20241本文件主要起草人：劉立兵、王建昌、孫曉霞、陳志敏、蒲靜、王金鳳、艾連峰、付琦、董振國(guó)。T/HBIQA0003.1—2024T/HBIQA0003.1—2024PAGEPAGE2食品中常見(jiàn)高組胺魚(yú)源性成分檢測(cè)方法第1部分：藍(lán)圓鰺實(shí)時(shí)熒光PCR法范圍本部分規(guī)定了食品中藍(lán)圓鰺源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本部分適用于食品中藍(lán)圓鰺源性成分的定性檢測(cè)。本部分所規(guī)定方法的最低檢出限（LOD）為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。（）GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。藍(lán)圓鰺Decapterusmaruadsi俗名巴浪、棍子魚(yú)，屬于鱸形目（Perciformes），鲹科（Carangidae），圓鲹屬（Decapterus）。實(shí)時(shí)熒光PCR real-time在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程。Ct值 cyclethresholdvalue每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。PCR（Polymerasechainreaction）DNA（deoxyribonuleicacid）coxICI（cytochromeoxidasesubunitI）dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）CTAB（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羥甲基（tris（hydroxymethyl）aminomethane）EDTA（ethylenediaminetetraaceticacid）FAM（carboxyfluorescein）BHQ11原理實(shí)時(shí)熒光法是在提取樣品DNA為模板，以藍(lán)圓鰺coxI基因中相對(duì)保守且高度特異的引物和探針進(jìn)行目標(biāo)物的實(shí)時(shí)熒光試劑和材料GB/T66821表1引物和探針序列名稱序列（5′-3′）目的基因內(nèi)參照F:TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA真核生物18Sr基因R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTP:FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-BHQ1藍(lán)圓鰺F:TGGCCTTCCCTCGAATGAcoxI基因R:CGGCCCCGGCTTCAP:FAM-CTTCTGACTACTCCCTCCGTCCTTCCTGC-BHQ1CTAB裂解液：20g/LCTAB，0.1mol/LTris-HCI（pH8.0），1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA（pH8.0）。CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl。蛋白酶K（20mg/mL），-2075%熒光預(yù)混液（2×）。TE（Tris-ClEDTA緩沖液mmol/Lmmol/L儀器和設(shè)備儀。12000g。7.5 （0.1μL～2.5μL,1μL～10μL,10μL～100μL,20μL～200μL,100μL～1000μL）。pH0.1。0.01g。均質(zhì)器。檢驗(yàn)步驟樣品前處理魚(yú)罐頭、魚(yú)腸、魚(yú)丸等食品取肉糜300mg，置于三氯甲烷:甲醇:水混合溶液(1:2:0.8)中室溫孵育過(guò)夜，去除油脂的肌肉組織可用于核酸提??；魚(yú)肉、魚(yú)排、魚(yú)糜等魚(yú)肉制品取300mg，用生理鹽水清洗后，放入研缽中，在研缽中倒入液氮，將樣品在液氮中研磨成粉末或用冷凍研磨儀研磨成粉末。DNA50mg2mL1.5mL10μLK，min12000r/min5min400μL:12000r/min5，吸取上清液至另一新離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，混勻后室溫下靜置1h12000r/min1050μLDNA-20℃保存DNADNA。DNA取適量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)260和A280。DNA的濃度按照公式（1）計(jì)算：c=A260×N×50 （1）公式（1）中：c ——DNA（μg/mL）；A260——260nm處的吸光值；N ——當(dāng)A260/A280比值在1.7～2.0之間時(shí)，適宜于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表2。每個(gè)樣品各做兩個(gè)平行管，可先將反應(yīng)試劑及引物預(yù)混成混合液。表2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系試劑名稱終濃度反應(yīng)體系/μL熒光PCR預(yù)混液（2×）1×12.5F(10μmol/L)320nmol/L0.8R(10μmol/L)320nmol/L0.8P(10μmol/L)320nmol/L0.8DNA模板(50-100ng/μL)—2.0補(bǔ)水至—25擴(kuò)增條件℃預(yù)變性30℃15℃35s（），40試驗(yàn)對(duì)照檢驗(yàn)過(guò)程中分別設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。以藍(lán)圓鰺提取的DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以已知不含有藍(lán)圓鰺的樣品提取的DNA為陰性對(duì)照，以滅菌水為空白對(duì)照。樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照各設(shè)置兩個(gè)平行。質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效：Ct值>40.0。Ct值>40.0。Ct值<30.0。Ct值＜30.0。結(jié)果判定在符合第9章的情況下，被檢樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)：a）Ct值≤35.0b）Ct值≥40.0c）如35.0＜Ct值＜40.0，則重復(fù)試驗(yàn)。如再次擴(kuò)增后Ct值仍為＜40.0，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，則判定被檢樣品陽(yáng)性；如再次擴(kuò)增后Ct值≥40.0，則判定為被檢樣品陰性。結(jié)果表述防污染措施檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的規(guī)定執(zhí)行。