溶血性曼氏桿菌診斷技術(shù)規(guī)范

1溶血性曼氏桿菌病診斷技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了溶血性曼氏桿菌病的診斷技術(shù)。本文件適用于牛、羊飼養(yǎng)場(戶)和動物診療單位對牛、羊臨床樣本和分離培養(yǎng)物中溶血性曼氏桿菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語與定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。Mh：溶血性曼氏桿菌（Mannheimiahaemolytica）PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）bp：堿基對（basepair）dNTPs：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TSA：胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticsoyagar）TSB：胰蛋白胨大豆肉湯（trypticsoybroth）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay）5流行病學(xué)由溶血性曼氏桿菌引起的牛、羊呼吸道疾病一年四季均發(fā)，秋冬季多見。6臨床診斷26.1臨床癥狀發(fā)病牛、羊主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、流涕，并伴有體溫升高、精神沉郁、厭食等。發(fā)病初期動物呼吸速率加快，繼而出現(xiàn)嚴重的呼吸困難，呼吸伴有啰音。6.2病理變化臨床病理變化以纖維素性滲出性肺炎、大葉性肺炎和胸膜肺炎為主。剖解后可見以下病理變化中一項或多項：病變肺質(zhì)地堅實、間質(zhì)增寬水腫、胸腔臟層和壁層均有纖維素附著、胸腔積液呈黃色或紅黃色、肺胸腔黏連。6.3結(jié)果判定牛、羊出現(xiàn)6.1或6.2的情況，可判定為疑似溶血性曼氏桿菌感染。確診應(yīng)采集有臨床癥狀或病理變化的牛羊鼻拭子、肺臟等組織或無菌采集血清，按實驗室診斷方法確診。7實驗室診斷樣品的采集與處理7.1器材7.1.1冷凍高速離心機。7.1.2組織勻漿器或研磨器。7.1.3手術(shù)剪刀和鑷子。7.1.4一次性密封袋。7.1.55mL凍存管。7.1.62mL凍存管。7.1.7采血針。7.1.8促凝采血管。7.2試劑7.2.1TSB培養(yǎng)基（配制方法見附錄A中的A.1）。7.2.20.01mol/LPBS溶液（配制方法見A.2）。7.2.375%酒精。7.3病料采集7.3.1將棉簽伸入鼻腔內(nèi)吸取分泌物，所有拭子采完后分別放入盛有3mLTSB培養(yǎng)基的5mL凍存管中，編號，記錄。采集的樣品密封后，采用保溫箱加冰密封后運送到實驗室。7.3.2采集新鮮解剖的未破損的牛、羊肺臟，氣管注入50mL～100mL滅菌的0.01mol/LPBS溶液,輕揉肺臟3min～5min,轉(zhuǎn)移5mL～10mL灌洗液分裝至2mL滅菌的凍存管中，采用保溫箱加冰密封后運送到實驗室。37.3.3將發(fā)病牛、羊剖檢后取肺、脾、肝等臟器和淋巴結(jié)組織，編號，記錄。采集的樣品密封后，采用保溫箱加冰密封后運送到實驗室。7.3.4采用75%酒精對待采血動物頸部靜脈表面皮膚進行擦拭消毒。用無菌采血針于頸靜脈處采血，立即插入促凝采血管中，充分混勻后編號、記錄，采用保溫箱運送到實驗室。7.4樣品處理7.4.1將采集鼻拭子中的棉簽擰干取出，5000r/min,離心20min。用5mL注射器吸出拭子液上清，分裝到2mL滅菌的凍存管中。貼標簽-80℃冰箱保存。7.4.2將組織樣品分解成2×2×3cm大小，將上述組織塊，用無菌剪刀剪碎后，加入5mL保存液，研磨成組織懸液凍融3次或超聲波裂解，8000r/min，離心20min。用5mL注射器吸出上清，分裝到2mL滅菌的凍存管中。貼標簽-80℃冰箱保存。7.4.3在4℃下，促凝管5000r/min,離心20min，取血清，分裝到2mL滅菌的凍存管中。貼標簽-80℃冰箱保存。8細菌分離與鑒定8.1器材8.1.1高壓滅菌鍋。8.1.2恒溫培養(yǎng)箱。8.1.3光學(xué)顯微鏡。8.1.4生物安全柜。8.1.5細菌培養(yǎng)皿。8.2試劑8.2.1TSA培養(yǎng)基（配制方法見A.3）。8.2.2革蘭氏染色試劑：草酸銨結(jié)晶紫染色液、番紅染色液、碘液和95%酒精，2℃~8℃條件下保存。8.2.3葡萄糖、阿拉伯糖、靛基質(zhì)等微量生化鑒定管，2℃~8℃條件下保存。8.3細菌分離8.3.1在無菌條件下，用接種環(huán)將按一定比例稀釋的鼻拭子液、支氣管肺泡灌洗液或發(fā)病牛羊的肺、脾、肝等組織材料劃線接種于TSA平板中，37℃培養(yǎng)24h，使之形成菌落，以供鑒定用。8.3.2取8.3.1中培養(yǎng)的圓形、光滑、濕潤和半透明菌落，在TSA平板上進行劃線接種純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24h后，出現(xiàn)上述菌落（見附錄B.1）。8.4涂布染色鏡檢8.4.1涂布：在載玻片上滴加1～2滴滅菌蒸餾水后，用接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的少量細菌與滅菌蒸餾水混勻并涂成薄菌膜。48.4.2干燥：將涂片至于空氣中自然晾干。8.4.3固定：將已干燥的載玻片涂面朝上，在酒精燈火焰上通過1～2次進行固定，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。8.4.4染色：采用革蘭氏染色法進行染色，一般包括初染、媒染、脫色和復(fù)染四個步驟，置1000倍（10×100）光學(xué)顯微鏡下觀察。8.4.5鏡檢：溶血性曼氏桿菌為革蘭氏陰性的球桿菌，菌體大小（0.3～0.5）μm×（1.0～1.8）μm，無芽孢、無鞭毛，有莢膜，可見兩極著色（見附錄B.2）。8.5生化鑒定溶血性曼氏桿菌可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、木糖、蔗糖和甘露醇，不發(fā)酵海藻糖和阿拉伯糖，靛基質(zhì)試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗和脲酶試驗陰性，可作進一步鑒定。9PCR檢測9.1器材9.1.1PCR擴增儀。9.1.2電泳儀。9.1.3水平電泳槽。9.1.4凝膠成像系統(tǒng)。9.1.51.5mL離心管。9.1.60.2mLPCR薄壁管或八聯(lián)管。9.2試劑除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純。試驗用水均符合GB/T6682-2008三級水規(guī)定。9.2.1細菌基因組DNA提取試劑盒，常溫條件下保存。9.2.2瓊脂糖（電泳級），2℃~8℃條件下保存。9.2.3DNA分子量標記DL1000，-20℃保存。9.2.4陰性對照、陽性對照：陰性對照為滅菌超純水；陽性對照為滅活的溶血性曼氏桿菌標準菌株。9.2.5PCR擴增用上、下游引物序列（見附錄B.3）。9.3細菌基因組DNA提取將初步鑒定為溶血性曼氏桿菌的菌株用商品化試劑盒進行基因組DNA提取。提取方法按試劑盒說明書進行。9.4PCR擴增每次進行PCR擴增時，除檢測樣品外，均需設(shè)置陽性對照和陰性對照。5PCR反應(yīng)體系：9.4.12×PCR反應(yīng)預(yù)混液12.5μL，模板DNA（空白對照用水代替）2μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O補足至25μL。9.4.2PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；50℃退火30s；72℃延伸40s；30個循環(huán)，72℃總延伸10min。9.5PCR產(chǎn)物電泳用1×TAE電泳緩沖液配制成2%瓊脂糖凝膠。取5μLPCR產(chǎn)物分別加入樣品孔，同時在一加樣孔中加入DNA分子量標準（DL1000），以5V/cm恒壓電泳，30min后采用凝膠成像系統(tǒng)判定核酸片段大小。9.6PCR結(jié)果判定9.6.1陽性對照出現(xiàn)一條230bp大小的條帶，且陰性對照不出現(xiàn)條帶。9.6.2在滿足9.6.1的條件下，被檢樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)一條230bp的條帶判定為核酸陽性（+）；被檢樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后不出現(xiàn)230bp的條帶判定為核酸陰性（-）。10間接ELISA抗體檢測10.1器材10.1.1酶標儀。10.1.2洗板機。10.2試劑10.2.1包被抗原：大腸桿菌表達的溶血性曼氏桿菌LktA重組蛋白。10.2.2酶標抗體：辣根過氧化物酶標記的驢抗綿羊二抗，兔抗牛二抗。10.2.3對照：Mh陽性血清、Mh陰性血清。10.2.4包被緩沖液（配制方法見A.4）。10.2.5封閉緩沖液（配制方法見A.5）。10.2.6洗滌緩沖液（配制方法見A.6）。10.2.7稀釋緩沖液（配制方法見A.7）。10.2.8TMB顯色液（配制方法見A.8）。10.2.9終止液（配制方法見A.9）。10.3檢測步驟10.3.1包被酶標板Mh重組LktA蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度為0.5μg/mL，每孔100μL包被96孔酶標板，4℃包被16h。用洗滌緩沖液洗板5次，每孔200μL，每次3min，洗滌結(jié)束后拍干。200μL/孔加入封閉緩沖液，37℃封閉2h，用洗滌緩沖液洗板5次后拍干。610.3.2ELISA操作步驟10.3.2.1酶標板上對照和樣品的分布圖，見圖1。在A1孔和B1孔加入Mh陽性對照血清各100μL，在C1孔和D1孔加入Mh陰性對照血清各100μL；剩余孔加入待檢樣品血清100μL，每孔兩個平行，37℃孵育2h，洗板同上。10.3.2.2每孔加入100μL的酶標抗體，37℃孵育45min，洗板同上。10.3.2.3每孔加入100μL的TMB顯色液，37℃避光孵育15min。10.3.2.4每孔加入50μL終止液終止顯色反應(yīng)，使用酶標儀測定450nm波長處的OD值。123456789APS3BPS3CNS4DNS4ES1S5FS1S5GS2S6HS2S6說明：P—陽性血清對照孔；N—陰性血清對照孔；S1、S2、S3、S4等—待檢血清孔，以此類推。圖1樣品加樣記錄表（推薦模式）10.3.3試驗成立條件陽性對照OD450＞1.5，且陰性對照OD450＜0.2，試驗結(jié)果有效；否則，應(yīng)重新進行試驗。10.3.4結(jié)果判定在試驗成立的前提下，待檢樣品OD450＞0.2，則判定該待檢樣品為Mh抗體陽性；待檢樣品OD450≤0.2，則判定該待檢樣品為Mh抗體陰性。11綜合判定11.1經(jīng)6.3判定為疑似Mh感染病例，經(jīng)細菌分離培養(yǎng)（見第8章）分離出溶血性曼氏桿菌，或經(jīng)PCR方法（見第9章）檢測出Mh核酸的，可判為溶血性曼氏桿菌感染。11.2臨床無明顯特異癥狀的非免疫動物經(jīng)間接ELISA方法（見第10章）檢測出抗體陽性的，可判為該動物曾經(jīng)疑似感染過Mh，需結(jié)合其他方法進行綜合確診。11.3臨床無明顯特異癥狀的牛、羊，經(jīng)第8章、第9章、第10章中任意一項檢測出陽性的，可判為溶血性曼氏桿菌感染（潛伏感染或持續(xù)感染）。7（規(guī)范性）試劑的配制A.1胰蛋白胨大豆肉湯胰蛋白胨大豆蛋白胨氯化鈉磷酸氫二鉀葡萄糖2.5gpH7.3±0.2準確稱取胰蛋白胨大豆肉湯（TrypticSoyBroth,TSB）30g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。A.20.01mol/LPBS溶液氯化鈉氯化鉀磷酸二氫鉀磷酸氫二鈉0.2g0.24g3.65gpH7.2將上述試劑加入到800mL蒸餾水中溶解，加水定容至1000mL，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15分鐘，室溫保存?zhèn)溆?。A.3胰蛋白胨大豆瓊脂胰蛋白胨大豆胨氯化鈉瓊脂5.0g5.0gpH7.3±0.2準確稱取胰蛋白胨大豆瓊脂（TrypticSoyAgar,TSA）40g，加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15分鐘，充分混勻后倒平皿。A.4包被緩沖液（0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液）碳酸鈉碳酸氫鈉去離子水0.318g0.588g200mL用0.22μm濾膜過濾除菌，室溫保存?zhèn)溆?。A.5封閉緩沖液（含3%BSA的PBST）pH7.4PBS吐溫-20BSA現(xiàn)配現(xiàn)用。A.6洗滌緩沖液—PBSTpH7.4PBS吐溫-20現(xiàn)配現(xiàn)用。A.7稀釋緩沖液（含1%BSA的PBST）pH7.4PBS吐溫-20BSA現(xiàn)配現(xiàn)用。A.8TMB顯色液1000mL0.5mL1000mL0.5mL1000mL0.5mLA.8.1底物液ATMB（分析純）無水乙醇或DMSO蒸餾水A.8.2底物液B磷酸氫二鈉（分析純）檸檬酸（分析純）0.75%過氧化氫尿素蒸餾水200mg加至1000