3.1重組DNA技術(shù)的基本工具課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

看到這張圖片你能想到什么可以改善我們生活的愿望嗎？樹：不能發(fā)光螢火蟲：能發(fā)光愿望發(fā)光樹如果能得到這種到了晚上自己能發(fā)光的樹該多好??！第3章基因工程按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。操作對象及環(huán)境操作水平操作原理結(jié)果環(huán)境：生物體外對象：基因DNA分子水平賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蛑亟M①【概念剖析】優(yōu)點？能克服遠緣雜交不親和的障礙；定向改造生物的遺傳特性。②基因工程理論基礎(chǔ)的分析【問題探究1】為什么不同生物的DNA分子能拼接起來？（1）DNA的基本組成單位都是

。（2）DNA分子都遵循

配對原則。（3）雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是

?！締栴}探究2】為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內(nèi)表達？（1）

是控制生物性狀的獨立遺傳單位。（2）遺傳信息的傳遞和表達都遵循

。（3）生物界共用一套

。四種脫氧核苷酸規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)基因中心法則遺傳密碼堿基互補【從社會中來】番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當番木瓜被這種病毒侵染后，產(chǎn)量會大大下降?？茖W(xué)家通過精心設(shè)計，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？轉(zhuǎn)基因“華農(nóng)1號”番木瓜非轉(zhuǎn)基因番木瓜第1節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀”準確切割DNA分子“分子縫合針”“分子運輸車”將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細胞限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”閱讀教材P71，回答下列問題：

3min1.限制酶的來源？2.限制酶的特點？3.限制酶的作用部位？4.限制酶的識別序列長度？5.限制酶的切割結(jié)果？自學(xué)指導(dǎo)一簡稱限制酶限制酶是用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。限制酶的命名是根據(jù)細菌種類而定，以EcoRI為例：

E：Escherichia

（屬名）

co：coli

（種加詞）

R：RY13（品系）

I：分離出的第一種限制酶資料卡

限制酶名字的由來EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個字母R型菌株從中分離的第一種限制酶EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一種限制酶。SmaⅠ：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一種限制酶。流感嗜血桿菌的d菌株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為：

。HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ資料卡

限制酶名字的由來一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”3.特點：4.作用部位:能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。特定部位的磷酸二酯鍵還記得磷酸二酯鍵在哪嗎

1.來源：主要從原核生物中分離純化出來的

2.種類：數(shù)千種（限制酶不是一種酶，而是一類酶）TACGGCATGCGCAT5′3′5′3′相鄰兩個核苷酸之間的鍵：磷酸二酯鍵CH2

HOHHHHH堿基

磷酸

5’4’3’2’1’脫氧核苷酸一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”5.識別序列長度？大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成；EcoRⅠSmaⅠTaqⅠ5’…T-C-G-A…3’3’…A-G-C-T…5’也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。特點1：都可以找到一條中心軸線；特點2：中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列。（1）實例1——EcoRⅠ限制酶切割

*EcoRⅠ識別序列為GAATTC*EcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端（2）實例2——SmaⅠ限制酶切割*SmaⅠ識別序列為CCCGGG*SmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵平末端6.切割結(jié)果:1.限制酶是一類酶而不是一種酶。2.限制酶作用于磷酸二酯鍵，而不是氫鍵。3.不同種類的限制酶識別的序列與切割的位點不同，這與酶的專一性是一致的。4.限制酶的識別序列與被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6個核苷酸組成，少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成；后者是雙鏈核苷酸序列。5.限制性內(nèi)切核酸酶可用于切割DNA以獲取目的基因，也可用于切割載體。6.兩個末端若是由同一種限制酶切割產(chǎn)生的，則兩片段連接后還具有該種限制酶的識別序列和切割位點?！揪毩?xí)1】：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________

GATCAATTAGCTGATC思考：同種限制酶切割的黏性末端一定相同嗎？不同種限制酶切出的黏性末端一定不同嗎？不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端【練習(xí)2】：教材P74課后題拓展應(yīng)用2有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ進行切割，B片段分別用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ進行切割，各限制酶的識別序列和切割位點如下：哪種限制酶切割B片段產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶SpeⅠ切割的A片段產(chǎn)生的DNA片段相連接，為什么？XbaⅠ因為XbaⅠ與SpeⅠ切割產(chǎn)生了相同的黏性末端（可互補）【練習(xí)3】請判斷：以下黏性末端是由

種限制酶作用產(chǎn)生的。3①②③【練習(xí)4】圖甲是一個DNA片段，箭頭處代表不同限制酶的切點，據(jù)圖回答：（1）用EcoRⅠ酶切，能得到

種DNA片段；（2）用PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；（3）同時用SmaⅠ和PstⅠ完全酶切，能得到

種DNA片段；（4）只用PstⅠ酶切，最多能得到

種DNA片段。2355【思考1】限制酶存在于原核生物中的作用是什么？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，起防御作用。原核細胞DNA中不存在限制酶的識別序列或能被識別的序列被修飾了?！舅伎?】為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？DNA連接酶——“分子縫合針”閱讀教材P72，回答下列問題：

4min1.DNA連接酶的作用？2.DNA連接酶的種類？3.對比分析DNA連接酶、DNA聚合酶及其他與DNA相關(guān)的酶？4.基因工程中使用的載體有哪些？5.質(zhì)粒的特點？6.載體需要具備哪些條件？自學(xué)指導(dǎo)二基因?qū)胧荏w細胞的載體——“分子運輸車”①E·coliDNA連接酶②T4

DNA連接酶將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。二、DNA連接酶——“分子縫合針”

1、作用：

2、種類：（只能連接黏性末端）（既可連接黏性末端，又可連接平末端）思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？大腸桿菌T4噬菌體歸納：比較DNA連接酶和DNA聚合酶種類DNA聚合酶DNA連接酶不同點作用實質(zhì)催化

與已有脫氧核苷酸鏈片段連接，形成

.

催化兩個

之間形成

.

作用結(jié)果催化形成與模板鏈互補的DNA鏈，形成新的雙鏈DNA分子催化具有

黏性末端或平末端的

連接起來，形成

.

模板

.

.

相同點①化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)；②都是催化形成

.單個脫氧核苷酸磷酸二酯鍵兩個DNA片段磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵需要不需要互補DNA片段重組DNA分子【核心歸納】與DNA相關(guān)的幾種酶的比較項目DNA連接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵氫鍵磷酸二酯鍵作用對象DNA片段DNA單個脫氧核苷酸DNADNA作用結(jié)果將兩個DNA片段連接成完整的DNA分子切割雙鏈DNA分子將單個脫氧核苷酸連接到DNA單鏈末端將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸載體種類：質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等三、基因?qū)胧荏w細胞的載體——“分子運輸車”質(zhì)粒：一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子?！咀⒁狻空嬲挥米鬏d體的質(zhì)粒，都是經(jīng)過過人工改造的。攜帶目的基因?qū)胧荏w細胞中，使之在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定存在并表達。最常用的載體——質(zhì)粒終止子:

轉(zhuǎn)錄的終點，在轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)控作用。啟動子:

RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的序列復(fù)制原點:

DNA復(fù)制的起始位點標記基因:便于重組DNA的篩選與鑒定其基因?qū)儆诩毎|(zhì)基因【分析歸納載體需要具備的條件】問題1：載體要與外源基因連接，需要具備什么條件？問題2：要使攜帶的外源基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，載體需要具備什么條件？問題3：我們用肉眼看不到載體是否進入受體細胞，為了便于篩選重組DNA分子，載體需要具備什么條件？條件①：具有一個或多個限制酶切割位點；條件②：能在受體細胞中進行自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制；條件③：具有標記基因，便于重組DNA分子的篩選。條件④：載體DNA必須是安全的，不會對受體細胞有害?！竞诵奶接憽繕擞浕虻暮Y選原理載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細胞，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，受體細胞對該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細胞。限制酶的選擇1.酶切位點要保證目的基因是完整的2.酶切位點要要位于啟動子和終止子之間（啟動子下游）限制酶DNA連接酶載體①對受體細胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標記基因；④能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒小結(jié)基因工程的基本工具作為載體的條件種類:磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來

1.DNA

酒精，某些蛋白質(zhì)

酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)。2.DNA在不同濃度的

中的溶解度不同，它能溶于

的NaCl溶液。DNA的粗提取與鑒定探究.實踐一、實驗原理3.在

下，DNA遇

試劑會呈現(xiàn)

。不溶于溶于NaCl溶液2mol/L二苯胺藍色一定溫度二、實驗材料新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、豬肝、雞血等原則上，凡是含有DNA的生物材料都可以考慮;DNA含量越高，成功的可能性越大。三、實驗試劑研磨液、體積分數(shù)為95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑、蒸餾水1.稱取約30g洋蔥，切碎后放入研缽中，倒入10mL

，充分研磨。2.（方案一）在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液

到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取

。（方案二）將研磨液倒入塑料離心管中，在1500r/min的轉(zhuǎn)速下

5min，再取

放入燒杯中。溶解并提取DNA研磨液過濾上清液離心上清液四、實驗步驟上清液中可能還含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)為減少DNA的損失，過濾過程一般使用紗布低溫放置幾分鐘的作用：①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少其斷裂。3.（方案一）在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的

（體積分數(shù)為95%），靜置2～3min，溶液中出現(xiàn)的

就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分。（方案二）將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下

5min，棄上清液，將

（粗提取的DNA）晾干。析出DNA，使DNA與雜質(zhì)分開酒精溶液白色絲狀物離心管底的沉淀物減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子4.取兩支20mL的試管，各加入5mL

。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。然后，向兩支試管中各加入4mL的

。混合均勻后，將試管置于

中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。2mol/L的NaCl溶液二苯胺試劑沸水（現(xiàn)配現(xiàn)用，用棕色瓶保存）（溶解DNA，并去除部分雜質(zhì)蛋白）溶液藍色的深淺與溶液中DNA的含量的多少有關(guān)對照組實驗組實驗結(jié)果不明顯的可能原因：①材料中的核物質(zhì)沒有充分釋放出來，研磨不充分或蒸餾水的量不夠；②加入酒精后搖動或攪拌時過猛，DNA被破壞；③二苯胺最好現(xiàn)用現(xiàn)配，否則二苯胺變成淺藍色，影響鑒定效果。以血液為實驗材料時，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止血液凝固。利用動物細胞提取DNA破碎細胞的方法：動物細胞無細胞壁，可直接吸水漲破。五、結(jié)果分析與評價思考：1.如果選用雞血細胞進行實驗，如何快速破碎細胞？2.有時會在DNA濾液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），這樣有什么好處？3.有時還會反復(fù)利用不同濃度的NaCl溶液來溶解、析出DNA，試猜想該操作的目的？將雞血細胞置于蒸餾水中，待細胞漲破后，收集濾液利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，不分解DNA，有利于DNA與蛋白質(zhì)分開進一步純化DNA。用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽溶液中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽溶液使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。刑偵破案拓展：DNA提取的應(yīng)用基因組測序插入人胰島素基因的大腸桿菌基因工程親子鑒定練習(xí)與應(yīng)用一、概念檢測1.DNA連接酶是重組DNA技術(shù)