分子生物學(xué)反應(yīng)

分子生物學(xué)反應(yīng)

主要內(nèi)容:

1）SDS的工作原理

蛋白酶和蛋白酶抑制劑的工作原理

（3）瓊脂糖凝膠不是通過聚合形成的

042乙醇是如何沉淀DNA和RNA的

5）堿裂解的工作原理

主要內(nèi)容列表

一、SDS的工作原理

SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是實(shí)驗(yàn)室常

用的基于蛋白質(zhì)分子量對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。

SDS根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量來分離蛋白質(zhì)，基于施加電場(chǎng)的

作用下通過篩分基質(zhì)（凝膠）產(chǎn)生的遷移率。

1.使蛋白質(zhì)的遷移率與分子量成正比

任何帶電物種在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)都是由其凈電荷、分子半徑和外加

電場(chǎng)的大小決定的。但自體折疊的蛋白質(zhì)所帶來的問題是，它們的凈電

荷和分子半徑都不依賴于分子量。相反，它們的凈電荷由氨基酸組成決

定，即蛋白質(zhì)中的氨基酸正、負(fù)電荷之和以及蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的分子半

徑?jīng)Q定。

因此，在它們的原生狀態(tài)下，具有相同分子量的不同蛋白質(zhì)在電

場(chǎng)中以不同的速度遷移，這取決于它們的電荷和三維形狀。

為了根據(jù)分子量在電場(chǎng)中分離蛋白質(zhì)，我們需要將蛋白質(zhì)還原為

線性分子，破壞三級(jí)結(jié)構(gòu)，并以某種方式掩蓋蛋白質(zhì)的固有凈電荷。這

就是SDS的應(yīng)用來源。

2.SDS的作用

SDS是一種存在于SDS緩沖液中的洗滌劑,在這種緩沖液

中，伴隨著一點(diǎn)煮沸和還原劑（通常是DTT或3ME來分解蛋白質(zhì)-蛋

白質(zhì)二硫鍵），它會(huì)破壞蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這將折疊的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

線性分子。

SDS破壞蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)

SDS利用均勻的負(fù)電荷覆蓋蛋白質(zhì)，從而掩蓋R-基團(tuán)的固有電荷。

SDS與線性蛋白（約1.4gSDS/lg蛋白）的結(jié)合相當(dāng)均勻，這意味著

蛋白質(zhì)的電荷現(xiàn)在與它的分子量近似成正比。

SDS也存在于凝膠中以確保一旦蛋白質(zhì)被線性化甩荷被掩蓋，

但蛋白質(zhì)在整個(gè)電泳分離過程中仍保持這種方式（與分子量成正比的遷

移）。

SDS包被的蛋白在凝膠中的遷移率的主要決定性因素是它的分子

半徑。

SDS包被的蛋白已被證明是線性分子，18A寬，長(zhǎng)度與分子量成

正比,因此分子半倒它們?cè)谀z中的遷移率）由蛋白質(zhì)的分子量決定。

由于SDS包被的蛋白質(zhì)具有相同的電荷質(zhì)量比，因此不存在基于電荷

的差異遷移。

3.凝膠基質(zhì)

在外加電場(chǎng)中，SDS處理后的蛋白質(zhì)現(xiàn)在將以不同分子量產(chǎn)生的

不同速率向陰極移動(dòng)。這些不同的遷移率將被凝膠基質(zhì)的高摩擦環(huán)境擴(kuò)

大。

SDS的凝膠基質(zhì)是聚丙烯酰胺，它具有化學(xué)惰性，并且至

關(guān)重要的是可以很容易地在各種濃度下制備不同的孔徑，可以產(chǎn)生不同

的分離特性。

4.不連續(xù)緩沖體系與濃縮凝膠

為了通過凝膠將電流從陽(yáng)極傳遞到陰極，需要緩沖液。我們通常

使用不連續(xù)Laemmli緩沖系統(tǒng)。"不連續(xù)”僅僅意味著凝膠和電泳槽

的緩沖液是不同的。

通常該系統(tǒng)采用PH6.8的Tris-HCI緩沖液配置的濃縮膠,pH8.8

的Tris-HCI緩沖液配置的分離膠以及pH8.3的電極緩沖液，濃縮膠具

有低濃度的丙烯酰胺，分離膠具有更高的濃度，能夠延緩蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)。

Tris-GlypH8.3-

Tris-HCIpH6.8

Tris-HCIpH8.8

Tris-GlypH83

非連續(xù)緩沖系統(tǒng)

那些不同的pH是怎么回事兒？甘氨酸可以以三種不同的電荷狀態(tài)存在,

正電荷、中性電荷或負(fù)電荷，這取決于pH值。用不同的緩沖液控制甘

氨酸的電荷狀態(tài)是整個(gè)濃縮膠的關(guān)鍵。

緩沖液pH對(duì)谷氨酸電荷的影響

同時(shí)，這也是濃縮膠的工作原理，當(dāng)電源接通時(shí)，在pH8.3電

極緩沖液中帶負(fù)電荷的甘氨酸離子被迫進(jìn)入濃縮膠（pH為6.8）,在

這種環(huán)境中，甘氨酸主要轉(zhuǎn)變?yōu)閮尚噪x子（中性電荷）狀態(tài)。電荷的這

種損失使它們?cè)陔妶?chǎng)中移動(dòng)得非常緩慢。

另一方面，氯離子（來源于Tris-HCI）在電場(chǎng)中移動(dòng)得很快，它

們形成一個(gè)離子鋒，在甘氨酸之前遷移。從Tris平衡離子（正朝陰極移

動(dòng)）中分離出的CI-形成一個(gè)具有陡峭電壓梯度的狹窄區(qū)，該電壓梯度

將甘氨酸往后拉，導(dǎo)致遷移離子產(chǎn)生兩個(gè)狹長(zhǎng)遷移前沿，高流動(dòng)性的

CI-前沿，然后是較慢的中性甘氨酸前沿。

所有凝膠中的蛋白質(zhì)樣本的電泳遷移率處在甘氨酸和CI-遷移率

的極值之間。因此當(dāng)兩個(gè)前沿進(jìn)入樣品孔時(shí)，蛋白質(zhì)濃縮到CI-和甘氨

酸之間的狹窄區(qū)。

5.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)離開濃縮膠

濃縮膠遷移過程結(jié)束后，進(jìn)入分離膠，pH轉(zhuǎn)變?yōu)?.8,在該pH

下，甘氨酸分子大多帶負(fù)電，遷移速度比蛋白質(zhì)快得多。因此，甘氨酸

加速通過蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)留在分離膠中。

結(jié)果是，蛋白質(zhì)在濃縮和分離膠的界面處被濃縮到非常窄的帶中，

并且由于分離膠中丙烯酰胺濃度的增加，這減緩了蛋白質(zhì)根據(jù)其分子量

大小的運(yùn)動(dòng)，分離開始。

6.濃縮膠起到了什么作用

濃縮膠膠孔約1cm深，通常需要填充足夠的蛋白在凝膠上。因此,

缺少濃縮膠的情況下，樣本則置于分離膠上，而樣本條帶將達(dá)到1cm

深。

與濃縮成一條帶同時(shí)進(jìn)入分離膠相比，沒有濃縮膠意味著蛋白質(zhì)

在不同時(shí)間分別進(jìn)入濃縮膠而形成彌散條帶。

因此，濃縮膠確保蛋白質(zhì)同時(shí)達(dá)到分離膠，分子量相同的蛋白質(zhì)

則形成緊密條帶進(jìn)行遷移。

7.蛋白質(zhì)分離

一旦蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠，則因高分子量蛋白質(zhì)通過多孔丙烯酰胺

凝膠的速度比低分子量蛋白慢而被分離。凝膠孔的大小可以根據(jù)丙烯酰

胺濃度和蛋白質(zhì)分子量大小而改變。

對(duì)于更寬的分離范圍，或?qū)τ陔y以分離的蛋白質(zhì)，可以使用具有

丙烯酰胺濃度增加的梯度凝膠。

二、蛋白酶和蛋白酶抑制劑工作原理

1.蛋白酶：好的，壞的，水解的

所有生物體都有蛋白水解酶和磷酸化酶，包括：你、我、甚至棉鈴蟲。

雖然蛋白酶涉及到從宿主防御到傷口愈合乃至病毒復(fù)制的各個(gè)方面,但

根據(jù)蛋白酶活性位點(diǎn)的構(gòu)胡口與目標(biāo)肽鍵的相互作用，可以大致分為兩

大類。

1）通過絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸在其活性部位的親核活化水解鍵；

2）天冬氨酸、谷氨酸和金屬蛋白酶，利用水本身進(jìn)行水解。

2.抑制劑:你不能只靠一種

化學(xué)分解、碰撞摩擦、超聲波和凍融，把整個(gè)系統(tǒng)都弄得亂七八

糟。沒有肽鍵是安全的！

外肽酶攻擊氨基酸鏈的末端，而內(nèi)肽酶水解它們的內(nèi)部連接。激

酶磷酸依口去磷酸化隨意。

沒有一種抑制劑能清除所有蛋白酶，阻止每一個(gè)磷酸化事件。它

需要一種“雞尾酒”的方法來阻止蛋白質(zhì)分解。蛋白酶抑制劑在脅迫下

可以不可逆、可逆和可逆地作用，可以是任何小分子，如氟化鈉，也可

以是進(jìn)化過程中自身微生物抑制劑多肽類似物。它們可以與底物競(jìng)爭(zhēng)活

性位點(diǎn)，有時(shí)會(huì)破壞或者囤積蛋白酶功能所需的珍貴陽(yáng)離子。

競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用是以類似底物的方式與活性位點(diǎn)結(jié)合通過修

飾阻止蛋白酶，例如，酯化反應(yīng)。許多大的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑通過增強(qiáng)親和性

和特異性結(jié)合。

競(jìng)爭(zhēng)性的阻礙因素。因素種類繁多，從抑肽酶，一種6kDa的多

肽絲氨酸蛋白酶(在極端的pH值是可逆的)，到正鋼酸鈉，一種抑制

易受騙蛋白-酪氨酸磷酸酶的小分子。

螯合劑利用它們對(duì)金屬離子的增強(qiáng)親和力與金屬離子螯合，而不

能與其他成員發(fā)生反應(yīng)。金屬蛋白酶的活性部位需要鋅、鎂、鎰、鈣,

甚至鉆來活化水，水解肽鍵，以達(dá)到水解目的。把鋅和乙二胺四乙酸

(EDTA)結(jié)合起來，把鈣和乙二胺四乙酸(EGTA)結(jié)合起來，金屬蛋

白酶就不再有活性了。

三、瓊脂糖凝膠不是通過聚合形成的

1.瓊脂糖凝膠不是通過聚合形成的

聚丙烯酰胺主要用于SDS,是由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰

胺單體組成的基質(zhì)。它的優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)惰性，因此在蛋白質(zhì)通過時(shí)不會(huì)與

蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，而且它可以用不同的孔徑輕松地、重復(fù)地制造出

具有不同分離特性的凝膠。

聚合反應(yīng)，是自由基催化的乙烯基加成反應(yīng)。該反應(yīng)由TEMED

引發(fā)，引發(fā)過硫酸錠(APS)自由基的生成。自由基將電子轉(zhuǎn)移到丙烯

酰胺/雙丙烯酰胺單體上，使它們呈放射狀并相互作用形成聚丙烯酰胺

鏈。

Potyacryidrr^de

Bii-acrylamide

OU-CH

I

coAcrylamide

jCH2=CH

NHl

QU+c-o

INH;S04?

NH

I

C-0

I

CHACH

NH4s2O8

(APS)

聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)

在缺失雙丙烯酰胺的情況下，丙烯酰胺會(huì)聚合成長(zhǎng)鏈，而不是多

孔凝膠。雙丙烯酰胺交聯(lián)丙烯酰胺鏈，是形成多孔凝膠基質(zhì)的原因。通

過改變丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的比例，可以控制交聯(lián)的量，決定凝膠的

孔徑和分離特性。

2.瓊脂糖凝膠形成

瓊脂糖一凝膠瓊脂的主要成分，可以從某些海藻中分離出來一本

身就是一種聚合物。但是，聚合不是瓊脂糖凝膠形成的機(jī)制。

在化學(xué)上，瓊脂糖是一種多糖，其單體單元是D-半乳糖和3,6-

脫水-L-半乳毗喃糖的二糖。

瓊脂糖的結(jié)構(gòu)

在低于35（的水溶液中，這些聚合物鏈通過非共價(jià)鍵相互作用

（像氫鍵）和靜電相互作用被保持在多孔凝膠結(jié)構(gòu)中。

加熱溶液會(huì)破壞這些非共價(jià)相互作用，并使鏈脫離。

當(dāng)溶液冷卻時(shí)，這些非共價(jià)相互作用被重新建立并且形成凝膠。

所以，瓊脂糖（和瓊脂）凝膠是通過氫鍵和靜電相互作用而不是

通過聚合形成的。

四、乙醇是如何沉淀DNA和RNA的

乙醇沉淀法是一種在水溶液中濃縮和脫鹽核酸（DNA或RNA）的常用

方法。最基本的步驟是在水溶液中加入鹽和乙醇，迫使核酸從溶液中沉

淀出來。

通過離心分離沉淀的核酸。核酸顆粒在70%的冷乙醇中洗滌，進(jìn)一步

離心后，干燥去除乙醇，核酸顆粒被重新懸浮在干凈的緩沖液中。

1.關(guān)于溶解度

首先我們需要知道為什么核酸能溶于水。水是一個(gè)極性分子，由

于非共享的電子對(duì)，它在氧原子附近有部分負(fù)電荷，在氫原子附近有部

分正電荷。

由于這些電荷，極性分子，如DNA或RNA,可以與水分子靜電

作用，使它們很容易溶于水。

因此，極性分子可以被描述為親水性分子，而非極性分子是疏水

性的，它們不易與水分子相互作用。

核酸是親水性的，這是由于糖磷酸主鏈上帶負(fù)電荷的磷酸（PO3-）

基團(tuán)。

水分子的極性

2.鹽的作用

鹽在實(shí)驗(yàn)中的作用是中和糖磷酸骨架上的電荷。一種常用的鹽是

醋酸鈉（乙酸鈉），在溶液中，乙酸鈉分解成NA+和[CH3co0]-。

帶正電的鈉離子中和了核酸上PO3-基團(tuán)的負(fù)電荷，使分子的親

水性大大降低，因此在水中的溶解度大大降低。

3.乙醇的作用

溶液中Na+離子與P03-離子之間的靜電吸引受庫(kù)侖定律的支配,

受溶液介電常數(shù)的影響。

水具有很高的介電常數(shù)，這使得Na+和P03-很難結(jié)合在一起。

另一方面，乙醇具有較低的介電常數(shù)，使得Na+更容易與P03-

相互作用，屏蔽其電荷，使核酸不太親水，導(dǎo)致其從溶液中脫落。

4.溫度的作用

低溫（如-20或-8（TC）下保存核酸/鹽/乙醇混合物用于沉淀核酸

通常在實(shí)驗(yàn)中認(rèn)為是必要的。

然而，這不是必需的，因?yàn)闈舛鹊椭?0ng/mL的核酸在0-4C

時(shí)會(huì)沉淀，因此在冰上孵育15-30分鐘就足夠了。

5.70%無(wú)水乙醇洗滌步驟

把沉淀的DNA顆粒中的殘留鹽洗掉。

6.關(guān)于核酸沉淀的一些建議:

a.鹽的選擇

使用醋酸鈉（0.3M終濃度，pH值5.2）進(jìn)行常規(guī)DNA沉淀;

對(duì)于含有SDS的DNA樣品，使用氯化鈉（終濃度為0.2M）,

因?yàn)镹aCI使SDS在70%乙醇中保持可溶性，因此不會(huì)與DNA一起

沉淀；

對(duì)于RNA，使用氯化鋰（0.8M終濃度）。這是因?yàn)?.5-3體積

的乙醇應(yīng)用于RNA沉淀，而LiCI比NaAC更易溶于乙醇，因此不會(huì)沉

淀，但要注意氯離子會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成和DNA聚合酶，因此LiCI不適

合用于體外翻譯或反轉(zhuǎn)錄RNA的制備。在這種情況下，使用NaACo

使用乙酸錠（2M終濃度）去除dNTPs，但不用于制備應(yīng)用于T4

多核甘酸激酶反應(yīng)的DNA,因?yàn)殄X離子抑制酶活性。

提高低濃度或小核酸片段沉淀的產(chǎn)率（＜100個(gè)核昔酸）

a.將MgCI2添加至最終濃度0.01M;

b.將離心前在冰上孵育的時(shí)間增加到1小時(shí)。

（下篇）

一、硅基質(zhì)離心柱制備DNA和RNA的工作原理

1.裂解

裂解方法可能會(huì)根據(jù)需要DNA或RNA而有所不同，但其共同點(diǎn)是含

有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。

雜化使氫鍵不穩(wěn)定，范德華力和疏水相互作用。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，包括核

酸酶，核酸與水的結(jié)合被破壞，為核酸與硅機(jī)制結(jié)合創(chuàng)造條件。

離液鹽包括鹽酸胭、異硫氨酸服、尿素和高氯酸鋰。

除了離液鹽，裂解緩沖液通常還含有洗滌劑，有助于蛋白質(zhì)的溶解和裂

解。

根據(jù)樣品類型，也可以使用酶進(jìn)行裂解。蛋白酶k就是其中之一，實(shí)際

上蛋白酶k在裂解緩沖液中起著非常好的作用；蛋白酶k的作用就越好,

蛋白質(zhì)變性越完全。然而，溶菌酶在裂解緩沖液的變性條件下不起作用，

因此，通常在加入變性鹽之前進(jìn)行溶菌酶處理。

對(duì)于質(zhì)粒的制備,裂解方式與提取RNA或基因組DNA有很大不同，

因?yàn)楸仨毾葟幕蚪MDNA中分離出質(zhì)粒。

如果加入離液鹽，將立即釋放胞內(nèi)物質(zhì)，并且無(wú)法從高分子量染色體中

區(qū)分出小的環(huán)狀質(zhì)粒。

因此，在質(zhì)粒制備中，直到裂解后，才加入離液鹽，并用于結(jié)合硅基質(zhì)。

2.結(jié)合硅基質(zhì)（Binding）

離液鹽對(duì)裂解和硅基質(zhì)的結(jié)合至關(guān)重要。

為了增強(qiáng)核酸與硅基質(zhì)的結(jié)合，在結(jié)合階段還加入了乙醇。通常是乙醇,

但有時(shí)可能是異丙醇。

乙醇的濃度和體積對(duì)結(jié)合有很大影響，濃度或體積太多會(huì)帶來大量降解

的核酸和小片段，進(jìn)而影響UV260的讀數(shù)，使核酸濃度降低。濃度或

體積太少，可能很難洗掉膜上的殘留鹽。

重要的一點(diǎn)是，乙醇會(huì)影響結(jié)合，并且添加的量對(duì)于任何試劑盒都是優(yōu)

化的。修改該步驟有助于獲得核酸提取的效果，因此如果遇到問題并希

望排除原因，則可以進(jìn)一步評(píng)估該步驟。

另一種問題的診斷方法，保留離心后過柱濾液，并進(jìn)行沉淀操作，看是

否有核酸。如果在裂解過程中使用SDS的表面活性劑，試著用NaCI

作為沉淀劑，以避免污染DNA或RNA。

3.洗滌步驟

裂解液通過硅膠膜離心，現(xiàn)在DNA或RNA與柱結(jié)合，雜質(zhì)，蛋白質(zhì)

和多糖則通過。

但是，膜仍然會(huì)被殘留的蛋白質(zhì)和鹽弄臟。如果樣本來自植物，膜上仍

會(huì)殘留多糖，可能還有一些色素，或者如果樣本是血液，膜可能呈棕色

或黃色。

清洗步驟有助于去除這些雜質(zhì)。通常有兩種清洗方式，但因樣本類型而

異。第一次洗滌通常會(huì)用少量的離液鹽來去除蛋白質(zhì)和有色污染物。然

后用乙醇清洗以除去鹽。如果樣本本身沒有太多蛋白質(zhì)，如質(zhì)粒準(zhǔn)備或

PCR產(chǎn)物純化，那么只需要乙醇清洗即可。

4.離心柱的干燥

乙醇洗滌后，大多數(shù)操作步驟都有離心來干燥離心柱。這是為了去除乙

醇，是清潔洗脫的必要步驟。當(dāng)10mMTris緩沖液或水填充到膜上進(jìn)

行洗脫時(shí)，核酸會(huì)水合并從膜上釋放。如果柱上還有乙醇，那么核酸就

不能完全再水化。

跳過干燥步驟會(huì)導(dǎo)致乙醇污染和核酸產(chǎn)量降低。

這個(gè)問題的主要跡象是當(dāng)試圖把樣品加載到瓊脂糖凝膠上時(shí)，即使在存

在染料的情況下，DNA不會(huì)下沉，而是漂浮在緩沖液中。乙醇污染的

另一個(gè)跡象是，如果你把樣品放在-20攝氏度，它不會(huì)結(jié)冰。

5.洗脫

最后一步是從硅基質(zhì)中釋放出純DNA或RNA。對(duì)于DNA的處理，通

常使用pH值在8-9之間的10mMTrisoDNA在稍微堿性的pH下更

穩(wěn)定，在緩沖液中溶解更快。即使是DNA顆粒也是如此。水往往趨向

于低pH值，低至4-5,在短時(shí)間內(nèi)洗脫時(shí)，高分子量DNA可能不完

全水化。通過讓緩沖液在離心前在膜中停留幾分鐘，可以最大限度地洗

脫DNA。

另一方面，RNA在弱酸性pH值下穩(wěn)定，因此水是首選洗脫液。RNA

很容易溶于水。

6.離心柱操作時(shí)容易出問題的事兒

核酸回收率低：因素有很多，通常是裂解問題，或者是過柱結(jié)合時(shí)條件

出現(xiàn)了問題。

確保使用新鮮的優(yōu)質(zhì)乙醺100%解釋緩沖液或添加到過柱結(jié)合步驟。

質(zhì)量差的乙醇或者長(zhǎng)期儲(chǔ)存的乙醇可能吸水，導(dǎo)致乙醇濃度發(fā)生變化,

如果洗脫緩沖液的配置出現(xiàn)問題，DNA或RNA就會(huì)被清洗時(shí)流失。

低純度：如果樣品被蛋白質(zhì)污染（低260/280）,那么可能是因?yàn)闃悠?/p>

太多，蛋白質(zhì)沒有完全去除或溶解。如果樣品的260/230比率很低，

則問題通常是來自結(jié)合緩沖液或洗滌緩沖液中的鹽。確保使用最高質(zhì)量

的乙醇來制備洗滌緩沖液，如果問題仍然存在，則提取是增加洗滌次數(shù)。

與其他樣品相比，一些樣品含有更多的抑制劑。環(huán)境樣品特別容易出現(xiàn)

純度問題，因?yàn)樵谔崛∵^程中腐殖物質(zhì)會(huì)被溶解。腐殖質(zhì)類似于DNA,

很難從硅膠柱中除去。對(duì)于這種類型的樣品，在過柱步驟之前需要使用

去除蛋白質(zhì)和腐殖質(zhì)的專門技術(shù)。

降解：主要是RNA，降解是由于樣品儲(chǔ)存不當(dāng)或者裂解效率過低造成

的，不過前提是用不含RNase的水洗脫，對(duì)于DNA預(yù)處理來說，降

解并不是一個(gè)大問題，因?yàn)閷?duì)于PCR來說，DNA有降解，擴(kuò)增依舊可

以良好進(jìn)行。但如果不希望DNA剪切過于嚴(yán)重，那么不要使用太強(qiáng)的

裂解方法。PCR純化注意事項(xiàng)：PCR純化是所有硅基質(zhì)離心柱技術(shù)中

最簡(jiǎn)單的，因?yàn)樗恍枰砑痈邼舛鹊慕Y(jié)合鹽(通常在每個(gè)PCR反應(yīng)

體系中添加3-5倍體積)并離心、柱體。因此，當(dāng)PCR純化試劑盒操作

失敗時(shí)，可能會(huì)特別令人沮喪。所以純化前，最好在凝膠上檢測(cè)一下擴(kuò)

增結(jié)果。

PCR反應(yīng)體系中太多物質(zhì)可在UV260處有吸收峰：核甘酸、洗滌劑、

鹽和引物。PCR純化試劑盒操作失敗多數(shù)是因?yàn)闆]有獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。

如果確定反應(yīng)體系中，有PCR產(chǎn)物且濃度不低，可以保留過柱后的液

體，如果DNA沒有發(fā)生結(jié)合，還可以進(jìn)行挽救，重新進(jìn)行純化。

二、DNA連接酶工作原理

DNA連接酶(EC6.5.1.1)以共價(jià)方式將DNA的磷酸骨架與平末端或

配對(duì)的粘性末端連接起來，其作用是修復(fù)DNA分子中斷裂的雙鏈。

Cohesiveends

5ATCTAGAGGATCCTACGTATCG3

TAGATCTCCTAGGATGCATAGC5

Bluntends

5ATCTACCCOGGCGTATCG—

TAGATGGGCCCGCATAGC5'

粘性末端與平末端示意圖

在分子生物學(xué)中，它通常用于將限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA片段插入載

體。商業(yè)連接酶提供含有ATP和Mg2+的反應(yīng)緩沖液，這兩種物質(zhì)對(duì)

連接酶活性都是必不可少的。

由于反復(fù)的凍融可能會(huì)破壞ATP,所以最好將溶液進(jìn)行分裝。

鏈接反應(yīng)本身有兩個(gè)基本步驟。首先，DNA末端必須偶然碰撞，并保

持在一起足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以便連接酶連接它們。

低溫反應(yīng)更容易。所有的分子在更高的溫度下移動(dòng)得更快，如果它們?cè)?/p>

低溫下輕輕地漂浮在溶液中，而不是像在更高的溫度下那樣呼嘯而過,

那么兩個(gè)DNA末端碰撞并保持在一起會(huì)更容易。對(duì)于粘性末端，較低

的溫度穩(wěn)定了互補(bǔ)核苜酸之間的氫鍵，有助于保持性對(duì)位置。

第二步是酶促反應(yīng)：DNA連接酶通過兩步催化3--0H與5'-磷酸基團(tuán)

連接。首先，與酶活性部位的賴氨酸殘基相連的AMP核甘酸被轉(zhuǎn)移到

5'-磷酸。然后磷酸腺苜鍵被3'-0H攻擊，形成共價(jià)鍵并釋放腺甘酸。

為了讓酶進(jìn)行進(jìn)一步的反應(yīng)，酶活性部位的AMP必須由ATP補(bǔ)充。

DNA連接酶在25（時(shí)具有最佳活性，因此連接反應(yīng)在使DNA末端連

接在一起的最佳溫度（1℃）和酶反應(yīng)（25（）之間的權(quán)衡溫度下進(jìn)行。

通常在EC下1小時(shí)是可以的，但是由于將DNA末端連接在一起是

反應(yīng)中最不有效的部分，因此通過將溫度降低到4＜來促進(jìn)這一點(diǎn)可以

提供更高的效率。然而，酶在這個(gè)溫度下工作非常緩慢，因此需要很

長(zhǎng)的（如過夜）反應(yīng)時(shí)間。

CCT?CCT

-GG-A-G---O-A

AMP

0CT4____cCT

-GG-A-G--

連接酶作用原理示意圖

三、比色分析的工作原理

1.對(duì)硝基苯基磷酸酯一分析機(jī)制

對(duì)硝基苯磷酸酯（pNPP）作為一種合成底物廣泛應(yīng)用于各種磷酸酶的

催化活性測(cè)定。pNPP的磷酸基團(tuán)被酶裂解生成對(duì)硝基苯酚，由于對(duì)硝

基苯酚在水中電子激發(fā)的最大波長(zhǎng)為318nm,因此對(duì)硝基苯酚也是無(wú)

色的。然而，在堿性條件下，對(duì)硝基苯酚轉(zhuǎn)化為對(duì)硝基苯酚陰離子，導(dǎo)

致向400nm左右的深色偏移（根據(jù)溶液條件將化合物的吸收峰改變?yōu)?/p>

較長(zhǎng)波長(zhǎng)）。這是電磁光譜的藍(lán)色邊緣，但是由于我們看到反射光的顏

色（與吸收光相反），溶液看起來是黃色的。

要記住的事情：

銘酸鹽轉(zhuǎn)移是分析的關(guān)鍵因素。

舉例來說，如果酶的活性要求在酸性范圍內(nèi)有一個(gè)最佳的pH值，那么

酸性磷酸酶的情況正好如此。

在這種情況下，為了獲得所需的黃色，必須在終點(diǎn)添加強(qiáng)堿（例如氫氧

化鈉或氫氧化鉀）。

2.孔雀綠一分析機(jī)制

對(duì)硝基苯磷酸測(cè)定是很好的,但是如果你最喜歡的磷酸酶不能有效地代

謝pNPP呢？另一種市面上可買到的磷酸酶測(cè)定法是孔雀綠測(cè)定法。這

種簡(jiǎn)單的測(cè)定方法是基于孔雀綠、鋁酸核和游離正磷酸鹽（又稱無(wú)機(jī)磷

酸鹽，pi）在酸性條件下形成的絡(luò)合物。

正磷酸鹽被磷酸酶分解后從磷酸化底物中釋放出來，在硫酸溶液中與鋁

酸鐵形成絡(luò)合物?？兹妇G磷鋁酸鹽絡(luò)合物的形成,在620-650nm處測(cè)

量，與游離正磷酸鹽濃度直接相關(guān)。因此，有可能量化蛋白質(zhì)磷酸酶底

物的磷酸化和磷酸釋放。

要記住的事情：

這種方法僅測(cè)量無(wú)機(jī)游離磷酸鹽;在測(cè)量之前，必須首先水解和中和有

機(jī)磷酸鹽(脂質(zhì)結(jié)合或蛋白質(zhì)結(jié)合磷酸鹽)。了解不同種類的有機(jī)磷酸

鹽及其各自不同的水解自由能有助于優(yōu)化分析條件。高能有機(jī)磷酸酯

(縮醛磷酸酯、酸酊等)具有不耐酸的磷酸基團(tuán)，可在低pH下孵育釋

放到溶液中。另一方面，低能有機(jī)磷酸鹽(磷酸酯)在酸性溶液中穩(wěn)定，

需要更苛刻的條件(如熱分解)才能用這種方法檢測(cè)。

在大量孔雀綠存在下，3:1離子締合物［(MG+)3(PMol2O403-)］容易

在酸性水溶液中形成和沉淀。為了穩(wěn)定水溶液中的1：1離子締合物，在

溶液中加入聚乙烯醇。

Enzyme*Substrate?.(ES)>Enzyme?P,

P,?(NHAMoO.K.H)PMOUO40

2e

H)PMOi204o?HMG*W.(MG)(H2PMou04o)?2H.

(yellow)(matocMegreen)(gre?a「乏》1叼)

(yHowf「446nm)

分析機(jī)制示意圖

在分析過程中要考慮的另T牛事是任何可能干擾分析的氧化還原反應(yīng)

的可能性。祖是一種過渡金屬，因此存在于多種氧化狀態(tài)。在鋁酸鹽陰

離子中，它具有+6的氧化狀態(tài)。通過有機(jī)化合物，如抗壞血酸和還原

糖(即葡萄糖)或無(wú)機(jī)化合物(如