病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及原理

病毒感染細(xì)胞試驗(yàn)整體流程及原理2023511目的基因不能直接整合到大多數(shù)真核細(xì)胞細(xì)胞，從而得到表達(dá)滿足試驗(yàn)需求。1、病毒的種類病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒慢病毒原理慢病毒〔Lentivirus〕是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的siRNA/miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的一般siRNA載體相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)展長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。特點(diǎn)直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用，適合RNAi爭(zhēng)辯和體(比方神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞)?？梢酝ㄟ^簡(jiǎn)潔方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物爭(zhēng)辯。無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡(jiǎn)便。可以依據(jù)客戶需要制備多種標(biāo)記。慢病毒包裝簡(jiǎn)要流程：含有目的基因的慢病毒RNAi干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等。培育48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培育液。病毒的純化和濃縮。分裝、-80℃保存。滴度測(cè)定目的基因檢定，并出具檢測(cè)報(bào)告。、腺病毒慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比較病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比較病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)〔Lentivirus〕腺病毒表達(dá)系統(tǒng)〔Adenovirus〕病毒基因組RNA病毒雙鏈DNA病毒復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制是否整合病毒基因組整合于宿主基因組，長(zhǎng)時(shí)病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因時(shí)表達(dá)外源基因感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞，適用于難轉(zhuǎn)感染分裂和不分裂細(xì)胞染的原代細(xì)胞〔如神經(jīng)細(xì)胞〕及體內(nèi)試驗(yàn)表達(dá)風(fēng)度中水平表達(dá)高水平表達(dá)腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復(fù)制不依靠于宿主細(xì)50Ad25，通過轉(zhuǎn)基因的方式取E1E3基因，降低病毒的復(fù)制力量。這些重組病毒僅在高水平表達(dá)E1E3基因的細(xì)胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的高效把握系統(tǒng)。特點(diǎn)幾乎可以感染全部類型的細(xì)胞可以獲得復(fù)制缺陷型(E1和E3缺失) 的腺病毒病毒滴度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過濃縮后可以到達(dá)1012PFU/mL，能有效的進(jìn)展增殖。腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備簡(jiǎn)潔，操作簡(jiǎn)潔.感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危急，生物安全性高。腺病毒包裝簡(jiǎn)要流程構(gòu)建表達(dá)siRNA/miRNA的腺病毒載體承受PacI消化純化的質(zhì)粒。消化好的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。將病毒粗提液感染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。分裝，-80℃保存。、慢病毒和腺病毒的比較表達(dá)時(shí)間表達(dá)時(shí)間慢〔1-3天〕快〔1-2天〕滴度10*8pfU/ml10*11pfU/ml克隆容量8kb的外源片段，滴度8kb的外源片段，滴度隨隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低插入片段長(zhǎng)度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、構(gòu)建目的基因到載體構(gòu)建手段一般是依據(jù)原始質(zhì)粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。1〕假設(shè)原始質(zhì)粒與載體有匹配酶切位點(diǎn)，承受相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到載體，酶切，并測(cè)序鑒定2〕假設(shè)沒有匹配的酶切位點(diǎn)，則設(shè)計(jì)帶有特別接頭的引物進(jìn)展PCR擴(kuò)增，得到目的片段，承受相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測(cè)序鑒定質(zhì)粒載體概念能夠進(jìn)展自主復(fù)制的環(huán)狀DNA雙鏈構(gòu)造，包括真核生物的細(xì)胞器〔主要指線粒體和葉綠體〕中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子特征粒稱為附加體(episome)為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制。通過個(gè)些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構(gòu)建在質(zhì)粒中，通過轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，利用選擇培育基來篩選從而不斷的復(fù)制，來得到目的產(chǎn)物。3DNA連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴(kuò)增粒，以下是質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化的三步驟。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落于3mlLB培育基的試管中，37℃振蕩培育過夜。40mlLB液體培育基中，372~3h10min4〕4℃離心10min〔4000r/min〕5〕倒出培育液，將管口倒置以便培育液流盡6〕用冰浴的0.1mol/L氯化鈣10ml懸浮細(xì)胞沉淀，馬上冰浴30min7〕410min〔4000r/min〕0.1mol/L2ml懸浮細(xì)胞〔冰上放置〕分裝細(xì)胞，200ul一份，4℃保存DNA的轉(zhuǎn)化200ul穎制備的感受態(tài)細(xì)胞，參加質(zhì)粒DNA2ul30min42℃保溫90s3〕2min每管加800ulLB液體培育基，37℃培育1h〔150r/min〕取適當(dāng)體積〔100ul〕的復(fù)蘇細(xì)胞，涂布在選擇性培育基上，正置30min6〕37℃，12~16h，消滅菌落質(zhì)粒提取步驟1min，棄上清加250ul溶液Ⅰ/RNaseA〔溶液Ⅰ為細(xì)胞懸浮液〕混合液，漩渦猛烈振蕩直至菌體完全重1-2min。參加250ul溶液Ⅱ〔細(xì)胞裂解液，輕柔的反復(fù)顛倒混勻5-6次。室溫放置1-2mi體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。參加350ul溶液Ⅲ〔中和液，馬上輕柔地反復(fù)顛倒混勻5-6淀。5〕1202310min，收集上清。6〕將上清置于DNA1-2min。7〕120231min，棄濾液。500ul溶液PB〔洗滌液〕120231min，棄濾液，目的是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量質(zhì)粒DNA。參加500ul溶液〔去鹽液12023轉(zhuǎn)離心1mi，棄濾液，重復(fù)一次。3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。11〕將DNA純化柱置于的離心管中，懸浮滴加50-100ul溶液Eluent〔為無菌的雙蒸水，PH為8.0-8.，室溫放置2mi。12〕120231min，此時(shí)管底即為高純度的質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒于-20℃保存。質(zhì)粒提取步驟：吸取液體培育基于1.5ml離心管中12023轉(zhuǎn)離心1min，棄上清，吸取培育基重復(fù)離心棄上清離心，留取少量菌液作為菌種保存，可直接置于-20℃——加250ulBufferS1懸浮細(xì)菌，懸浮均勻——加250ulBufferS2溫存充分的上下翻轉(zhuǎn)4-6350ulBufferS3溫存上下翻轉(zhuǎn)1202310min〔2m120231mi轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液——加500ulBufferW212023轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，重復(fù)一遍——將制備管置回2ml120231min——將制備管移入的1.5ml離心管中，加60~80ulEluent或離子水，室溫1min120231min4℃或是-20℃保存4DNA293T〔即病毒包裝〕名詞解釋4.1.1293T細(xì)胞是由293細(xì)胞派生,表達(dá)SV40大T抗原的人腎上皮細(xì)胞系, 被廣泛應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以過表達(dá)各種目標(biāo)蛋白,或是用以包裝病毒。4.1.2脂質(zhì)體：某些細(xì)胞質(zhì)中的自然脂質(zhì)小體，可作為生物膜，用于捕獲外源性物質(zhì)后更有效地運(yùn)送到靶細(xì)胞，經(jīng)同細(xì)胞融合而釋放。共轉(zhuǎn)染的操作步驟第一天：用無抗生素DMEM+10%FBS293FT細(xì)胞，2ml/孔。確保其次天細(xì)胞密度到達(dá)80%-90%融合度其次天：500ul2ug表達(dá)質(zhì)粒+1.5ugpsPAX2+1.5ugpMD2.G500ul15ul20235min后，將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液混合，室溫靜止20min61ml無血清培育基，然后滴參加1ml質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物。6-10hDNA-DMED+10%FB〔從今刻開頭算時(shí)間。第三天：1.24h后，熒光顯微鏡下觀看，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)到達(dá)70%以上第四天：1.4872h分別收獲含病毒的上清。2.3000rpm20min，0.45um濾膜過濾，去除細(xì)胞沉淀。3.12023轉(zhuǎn)離心濃縮細(xì)胞、分裝-80°C貯存。4.滴度測(cè)定目的基因檢定，并出具檢測(cè)報(bào)告。病毒包裝的原理質(zhì)粒DNA為能轉(zhuǎn)錄出慢病毒遺傳物質(zhì)RN，但不能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質(zhì)粒，其同時(shí)連有目的基因和報(bào)告基因，psPAX2為能表達(dá)慢病毒外殼的質(zhì)粒，其表達(dá)產(chǎn)物可通過粘附機(jī)制更易穿過細(xì)胞膜， pMD2.G為慢病毒的膜蛋白質(zhì)粒，通過lipofectamine2023進(jìn)展三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到靶細(xì)胞基因組中，宿主基因組在表達(dá)時(shí)，隨宿主基因轉(zhuǎn)錄出的目的基因RNA與psPAX2、pMD2.G基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用該病毒感染靶細(xì)胞，病毒進(jìn)入RNA反轉(zhuǎn)錄出DNADNARNA和表達(dá)目的基因卻不能表達(dá)出病毒的外殼和膜蛋高效的將目的基因轉(zhuǎn)然到靶細(xì)胞基因組中。5、慢病毒感染細(xì)胞流程圖感染步驟鋪板：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化重懸后，按1*105/L密度接種于12孔板，生長(zhǎng)過夜感染：將70-80%12孔板中的培育液吸除，換穎的培育液，同時(shí)參加PBS濃度梯度稀釋的病毒液，混合均勻后即可放入孵箱培育。3)24h左右可換液，48小時(shí)即可看熒光，具體依據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來看。熒光顯微鏡的操作流程翻開熒光器30min內(nèi)不能關(guān)閉，否則影響顯微鏡壽命，細(xì)胞培育板置于載物臺(tái)，調(diào)整物鏡和光圈，先用自然光觀看視野內(nèi)細(xì)胞，再關(guān)閉光，開啟熒光通道，觀看熒光強(qiáng)度，判〔針對(duì)leica〕留意事項(xiàng)內(nèi)容病毒濃度要適宜，太少的話細(xì)胞被感染的也少，但是病毒濃度太大，對(duì)細(xì)胞有損害。10h左右可依據(jù)培育基顏色加培育基。在不明確細(xì)胞感染復(fù)數(shù)狀況下，可進(jìn)展?jié)舛忍荻雀腥?，?jì)算細(xì)胞感染復(fù)數(shù)。24h左右可換液，48小時(shí)即可看熒光，具體時(shí)間依據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來看。6、感染后的細(xì)胞檢測(cè)方法熒光初步檢測(cè)檢測(cè)，熒光有強(qiáng)弱之分，與病毒參加的量有關(guān)。RNART-PCR檢測(cè)原理由于真核細(xì)胞DNADNA轉(zhuǎn)錄成為RNA切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才能形成真正的mRN相應(yīng)的蛋白，只能通過提取其mRNA并RT-PCR這條途徑來測(cè)定RNA提取步驟加1mlTrizo1.5ml100ul氯仿猛烈振蕩30s12023轉(zhuǎn)15min，可看到明顯分層；取上層透亮液體至的1.5ml離心管中，加等體積的異丙醇，10min，1202310min1ml70%乙醇，12023轉(zhuǎn)，離心10min，棄上清，風(fēng)干剩余液體，最終加DEPC-水溶解RNA，電泳，粗步判定RNA純度。6.2.3RT-PCR步驟：RTRNA，在參加引物，模版和酶，并在PCR儀的溫度設(shè)置下，RNA可逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下進(jìn)展復(fù)制成雙鏈DNA〔具體步驟省略〕Western檢測(cè)western-Bloting：蛋白免疫印跡〔Westernblotting 或Immunoblotting〕一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測(cè)三個(gè)局部組成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。其次步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝