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TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofduckTembusuVirusHYPERLINK安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。1鴨坦布蘇病毒分離鑒定技術(shù)規(guī)程本標準規(guī)定了鴨坦布蘇病毒病料采集與處理、病毒接種及鑒定技術(shù)。本標準適用于鴨坦布蘇病毒的分離與鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。DB34/T1938鴨黃病毒感染診斷技術(shù)規(guī)程3試驗材料、試劑3.19~11日齡SPF雞胚3.211日齡鴨胚3.3乳倉鼠腎細胞(BHK-21)3.4DMEM培養(yǎng)基3.5胎牛血清3.60.01mol/LpH7.0~7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)3.7TAE緩沖液(50×)3.8青霉素、鏈霉素3.9瓊脂糖3.10鴨坦布蘇病毒瓊脂擴散抗原(由鴨坦布蘇病毒安徽分離株醛滅活制備而成)3.11鴨坦布蘇病毒瓊脂擴散抗體(由鴨坦布蘇病毒安徽分離株油乳佐劑滅活制劑免疫健康兔,份離血清制備而成)4病料采集與處理4.1病料的采集無菌采集疑似鴨坦布蘇病毒感染的病鴨卵巢、輸卵管、胰腺和腦組織。樣品應(yīng)置于-80℃凍結(jié)保存。4.2病料的初步處理先將病料組織剪碎、研磨,用滅菌PBS與樣品按體積質(zhì)量比5:1勻漿,將樣品勻漿放置于-20℃中冷凍,再室溫融解,反復(fù)三次。經(jīng)5000r/min離心10min,取上清,并加入青霉素和鏈霉素,終濃度為2000IU/mL,0.22μm過濾除菌,置于-80℃待用。25病料接種將上述病毒分離材料,以0.2mL/胚的接種量通過尿囊腔接種5枚9~11日齡SPF雞胚,置37℃孵化箱內(nèi)孵育,每天照胚2~4次,棄去24h內(nèi)死亡的雞胚,孵化至120h,將雞胚放置4℃冰無菌操作收集24h以后死亡雞胚及120h仍存活雞胚的尿囊液,并觀察病變。將上述病毒分離材料,以0.2mL/胚的接種量通過尿囊腔接種5枚11日齡鴨胚,其余方法同取密度80%左右的單層BHK-21細胞,棄去培養(yǎng)液,用滅菌PBS清洗三次,接種0.5mL處理好的病料,置于5%CO?培養(yǎng)箱,37℃下吸附1~2h,期間每隔15min輕輕搖晃一次。吸附完后,棄去病料液,用滅菌PBS清洗三次,加入適量細胞維持液繼續(xù)培養(yǎng),37℃CO?培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4d。在培養(yǎng)過程中每日觀察細胞病變(CPE)產(chǎn)生情況,如出現(xiàn)CPE(特征病變?yōu)椋杭毎g隙增大、細胞核固縮、細胞圓化脫落),收集細胞培養(yǎng)上清及細胞裂解液。同時設(shè)立不接種樣品的空白細胞對照瓶。6病毒鑒定1938鴨黃病毒感染診斷技術(shù)規(guī)程,或者使用瓊脂擴散試驗對鴨坦布蘇病毒進行鑒定。用1×TAE緩沖液配置1%瓊脂糖,煮沸溶解,冷卻至60℃左右,倒入平皿(直徑9cm)中制作瓊脂糖凝膠板,瓊脂糖凝膠厚度約4mm,完全凝固后備用。用梅花打孔器在上述瓊脂糖凝固板上打孔,用孔徑5m、孔距奮品射孔結(jié)束店取適量1%瓊脂7.3加樣用移液器在中間孔加入坦布蘇病毒陽性血清,1號孔加入坦布蘇病毒瓊擴標準抗原,2~6號孔加每孔樣品加滿,不可溢出(圖1)。完成加樣后,將瓊脂板倒置放入濕盒內(nèi),置于37℃培養(yǎng)箱中24~36h。35423圖18結(jié)果判定8.1由本病毒致死的雞胚及鴨胚具有基本相同的肉眼病變。胚體小、絨毛尿囊膜增厚、胚體充血及胚肝出血。8.2BHK-21細胞接種病料48h后,開始出現(xiàn)細胞核固縮、細胞圓化脫落。8.3RT-PCR檢測結(jié)果出現(xiàn)目的片段時,初步判定為鴨坦布蘇病毒陽性。8.4被檢樣品孔與陽性血清孔之間形成一條致密白色沉淀帶,并與陽性對照沉淀帶平滑相連,即可判斷為陽性。8.5被檢樣品孔與陽性血清孔之間無沉淀帶出現(xiàn);出現(xiàn)的沉淀帶與陽性對照交叉或者不相連,為非特異性反應(yīng),也判定為陰性。8
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