第三章 基因工程制藥課件

第三章基因工程制藥第三章基因工程制藥基因工程的基礎(chǔ)知識

第一節(jié)基因的概念與特性

一、基因的概念:

DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。早期認(rèn)為遺傳物質(zhì)是蛋白質(zhì)，1944年Avery從肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明是DNA。第三章基因工程制藥A：S有夾膜致病菌，B：R突變非致病菌，C：加熱殺死S菌，D：活R死S第三章基因工程制藥二、基因的一般特性：①基因可自我復(fù)制②基因決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)③基因可突變?；虬垂δ芊譃椋孩俳Y(jié)構(gòu)基因②調(diào)控基因第三章基因工程制藥三、DNA的結(jié)構(gòu)與性能⒈DNA的結(jié)構(gòu)：四種核苷酸（A、T、C、G）連接。DNA二級結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)。⒉DNA的性質(zhì)與功能①吸收光譜260②電場中泳動(dòng)③變性、復(fù)性、雜交第三章基因工程制藥第二節(jié)DNA的復(fù)制與表達(dá)一、DNA的復(fù)制：半保留復(fù)制第三章基因工程制藥

二、基因表達(dá)

⒈轉(zhuǎn)錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為模板合成mRNA的過程。

轉(zhuǎn)錄后加工：剪切：除去內(nèi)含子加帽：5’加m7Gppp

加尾：3’加poly（A）第三章基因工程制藥

二、翻譯：以mRNA為模板，tRNA作為運(yùn)載工具，將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質(zhì)的過程。

⒈

分為三個(gè)階段：①起始②延長③終止第三章基因工程制藥

基因表達(dá)第三章基因工程制藥真核細(xì)胞的翻譯過程第三章基因工程制藥⒉翻譯后的肽鏈加工肽鏈切斷①羥基化②糖基化③磷酸化④乙?；谌禄蚬こ讨扑?/p>

基因工程制藥第三章基因工程制藥第一節(jié)概述20世紀(jì)70年代基因工程誕生最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域。

1982年第一個(gè)基因工程產(chǎn)品--人胰島素在美國問世。

優(yōu)點(diǎn):大量生產(chǎn)、應(yīng)用臨床、深入研究、擴(kuò)大應(yīng)用、改造不足、擴(kuò)大了藥物篩選來源。第三章基因工程制藥基因工程藥物基因工程藥物和制劑很珍貴，用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)，由于材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法大量生產(chǎn)，但用基因工程可以得以解決。主要是醫(yī)用活性蛋白和多肽類：（1）免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體（2）細(xì)胞因子，如各種干擾素、白細(xì)胞介素、表皮生長因子、凝血因子等（3）激素，如胰島素、生長激素、心鈉素等（4）酶類，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、超氧化物歧化酶等第三章基因工程制藥利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)（1）：①大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽(如胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等)，為臨床使用提供有效的保障；②可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；③可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；第三章基因工程制藥利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)（2）：④內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處，可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除。如白細(xì)胞介素-2的第125位半胱氨酸是游離的，有可能引起—S—S—鍵的錯(cuò)配而導(dǎo)致活性下降，如將此半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸，白細(xì)胞介素-2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高。⑤利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。第三章基因工程制藥國際上已進(jìn)入臨床試驗(yàn)的抗腫瘤重組導(dǎo)向毒素基因工程抗腫瘤藥物目前進(jìn)入臨床試驗(yàn)的基因組重組抗血管生成藥物轉(zhuǎn)基因養(yǎng)殖動(dòng)物的乳汁產(chǎn)生的人生物醫(yī)藥轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的藥物蛋白第三章基因工程制藥部分基因工程藥物簡介：1、人胰島素(InsuIin)胰島素是多肽激素的一種，具有多種生理功能，在維持血糖恒定，增加糖原、脂肪、某些氨基酸和蛋白質(zhì)的合成、調(diào)節(jié)與控制細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑等方面都有重要作用。胰島素用于臨床糖尿病的醫(yī)治已有近70年的歷史，長期以來，其來源僅僅是從動(dòng)物的胰臟中提取，而動(dòng)物胰島素與人胰島素在氨基酸組成上存有一定的差異，長期注射人體時(shí)會(huì)產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，影響治療效果。自80年代初開始，人們已開始用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)人胰島素。第三章基因工程制藥人胰島素的基因工程生產(chǎn)一般采用兩種方式：一是分別在大腸桿菌中合成A鏈和B鏈，再在體外用化學(xué)方法連接兩條肽鏈組成胰島素。美國EIiLilly公司采用該法生產(chǎn)的重組人胰島素Humulin最早獲準(zhǔn)商品化；另一種方法是用分泌型載體表達(dá)胰島素原，如丹麥NovoNordisk公司用重組酵母分泌產(chǎn)生胰島素原，再用酶法轉(zhuǎn)化為人胰島素。第三章基因工程制藥對胰島素的改造NovoNordisk研究所的Brange等應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在胰島素分子中取代一個(gè)氨基酸殘基，防止單體二聚化，由此合成的新型胰島素在藥物濃度下基本上保持單體，注射后吸收速度比正常胰島素快2-3倍；另有報(bào)道將胰島素B鏈第10位的His變?yōu)锳sp獲得高活力胰島素B10Asp，其受體結(jié)合能力和離體生物活力分別為豬胰島素的262％和235％。第三章基因工程制藥

2．人生長激素(Humangrowthhormone，hGH)人生長激素是人的垂體腺前葉嗜酸細(xì)胞分泌的一種非糖基化多肽激素。它有多種生物功能，主要是刺激身體生長。最近發(fā)現(xiàn)hGH對一些細(xì)胞的增殖和分化以及DNA合成有直接效應(yīng)。hGH的主要用途是治療誅儒癥，臨床試驗(yàn)認(rèn)為hGH對慢性腎功能衰竭和Turner綜合癥也有很好療效。第三章基因工程制藥美國的Genentech公司采用枯草芽泡桿菌系統(tǒng)表達(dá)hGH，產(chǎn)量達(dá)1.5g/L，于1985年10月批準(zhǔn)上市，商品名稱為Prptropin(hGH)。1994年3月又有新產(chǎn)品Nutyopin被批準(zhǔn)上市。英國Cellteck公司用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的hGH，比從垂體中提純的天然hGH多一個(gè)蛋氨酸，其治療效果更為顯著。我國用E.coli和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)hGH，1995年開始進(jìn)行臨床試驗(yàn)．做完臨床試驗(yàn)后有兩家公司進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。第三章基因工程制藥

3、干擾素(Interferon，IFN)干擾素是一類在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，其活性的發(fā)揮又受細(xì)胞基因組的調(diào)節(jié)和控制，涉及RNA和蛋白質(zhì)的合成。干擾素是一種類似多肽激素的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，是一種細(xì)胞素。其定義包括如以下含義：(1)干擾素必須是一種蛋白質(zhì)；第三章基因工程制藥(2)在一般生理狀態(tài)下，細(xì)胞的干擾素基因呈靜止?fàn)顟B(tài)，只有在特定誘生劑作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯出具有種屬特異性的干擾素；(3)干擾素本身不能直接滅活病毒，而是細(xì)胞在干擾素作用后產(chǎn)生出多種抗病毒蛋白。從而阻斷病毒的繁殖；(4)干擾素必須具有廣譜抗病毒活性。第三章基因工程制藥

根據(jù)抗原特異性和分子結(jié)構(gòu)的不同，干擾素可分為α、β、γ三型。干擾素的基本特性包括種屬特異性、作用“廣譜性和選擇性”、相對無害性和特殊穩(wěn)定性等。干擾素的生物功能活性可歸納為：(1)抗細(xì)胞內(nèi)侵害微生物活性，(2)抗細(xì)胞分裂活性，(3)調(diào)節(jié)免疫功能活性。干擾素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病。我國衛(wèi)生部已批準(zhǔn)生產(chǎn)的干擾素品種有：IFNα1b、IFNα2a、IFNα2b和IFNr四種。第三章基因工程制藥4．白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)白細(xì)胞介素是由白細(xì)胞或其他體細(xì)胞產(chǎn)生的又在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用和介導(dǎo)作用的因子，是一類重要的免疫調(diào)節(jié)劑。目前已發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素已達(dá)15種之多，它們的生物學(xué)功能十分廣泛．主要功能有：(1)激活并刺激T、B淋巴細(xì)胞的增殖和分化；第三章基因工程制藥(2)刺激巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的活性；(3)作為各種細(xì)胞的絲裂原；(4)其他功能(抗腫瘤作用、誘導(dǎo)發(fā)熱、作為佐劑等)。白細(xì)胞介素在臨床上主要用于治療惡性腫瘤和病毒性疾病(如乙型肝炎、艾滋病等)。第三章基因工程制藥隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，各種白細(xì)胞介素的基因也相繼克隆成功，并制成基因工程白細(xì)胞介素純品，其中有幾種已投放市場。同內(nèi)IL-2已批準(zhǔn)生產(chǎn)，IL-3、IL-4和IL-6等其他白細(xì)胞介素也正在研制中。應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)在IL-2中125位Cys分別由Ser或Ala取代，制成生物活性、熱穩(wěn)定性和復(fù)性效果都比原IL-2強(qiáng)的新型IL-2(125Ser-IL-2和125Ala-IL-2)，現(xiàn)己獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用。第三章基因工程制藥5.集落刺激因子(Colony–stimuLatingfactor,CSF)集落刺激因子(CSF)是一類能參與造血調(diào)節(jié)過程的糖蛋白分子，故又稱造血刺激因子或造血生長因子。CSF的功能可概括為：刺激造血細(xì)胞增殖、維系細(xì)胞存活、分化定型、刺激終末細(xì)胞的功能活性等。近年來的研究表明，CSF還參與對成熟細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，并在宿主抗感染免疫中起著重要作用。第三章基因工程制藥現(xiàn)在已知的集落刺激因子(CSF)主要有4種：(1)粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)；(2)巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)；(3)粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-C3F)；(4)多能集落刺激因子(Multi-CSF，即IL-3)。上述4種CSF在注入人體后均有促使各類白細(xì)胞增殖和成熟、增加血小板和紅細(xì)胞數(shù)量的作用，因此CSF在臨床上多用作癌化療的輔佐藥物，如化療后產(chǎn)生的中性白細(xì)胞減少癥，也用于骨髓移植促進(jìn)生血作用，還可用于治療白血病、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙貧血等多種疾病。第三章基因工程制藥6．腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactor，TNF)腫瘤壞死因子這一名稱是因最初發(fā)現(xiàn)時(shí)觀察到它的抗腫瘤活性而命名的。隨著人們對TNF的深入研究，該名稱已不再能反映其全部的生物活性。TNF除具有抗腫瘤活性外．對多種正常細(xì)胞還具有廣泛的免疫生物學(xué)活性，如炎癥活性，促凝血活性，促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，免疫調(diào)節(jié)作用，抗病毒、細(xì)菌和真菌作用，熱原質(zhì)作用以及參與骨質(zhì)重吸收等。第三章基因工程制藥目前TNF經(jīng)鑒定有3種1)主要由激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α；(2)主要由激活淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的INF-β，又名淋巴細(xì)胞毒素(LT)；(3)由NK細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒因子TNF-γ。(NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，具有廣泛的生物學(xué)功能，位于機(jī)體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線。NK細(xì)胞作為天然免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，在感染性疾病的防治、腫瘤的生物治療以及骨髓移植中發(fā)揮了不可替代的作用。皮膚黏膜組織是機(jī)體的重要免疫器官之一，是阻擋病原微生物入侵的天然屏障，而NK細(xì)胞是這一屏障的主要效應(yīng)細(xì)胞之一。

)第三章基因工程制藥1984年基因重組TNF獲得成功后，1985年即獲美國FDA批準(zhǔn)用于臨床，在治療某些感性腫瘤上收到較好的效果。此外，TNF在臨床診斷上也有一定意義。但天然TNF有一定毒副反應(yīng)。國內(nèi)1989年首次報(bào)道組建高表達(dá)人TNF工程菌株。并通過鑒定，重在研究TNF的衍生物，以提高比活性和減少毒副作用。第三章基因工程制藥目前，用蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制TNF突變體主要有：(1)將原型TNF分子中第80、90和92位的Ile、Lys和Asn分別被Ser、His和Val置換，經(jīng)E.coli表達(dá)產(chǎn)生rhTNFαD3a產(chǎn)物，毒性比原型TNF低11倍左右；(2)將TNF—αN末端的第2位Arg換成Lys，在及E.coli中表達(dá)TNF—K2產(chǎn)物，對某些人腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出比TNP—α高出幾十倍到幾百倍的抑制活性，且毒性稍低；第三章基因工程制藥(3)在TNF分子的末端缺7個(gè)氨基酸，8、9、10和C端157位氨基酸分別被Arg—Lys—Arg和Phe取代，在E.coli中表達(dá)TNFmutantprotein產(chǎn)物，生物活性比天然的提高10倍，可降低用藥量，減低其毒副作用，且產(chǎn)物以可溶形式存在，易于純化。第三章基因工程制藥7．心鈉素(AtrialnatriurcticfactorANF或ANP)心鈉素是心房利鈉因子。由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于一種多肽，故又稱心房肽(ANP)。心鈉素具有較強(qiáng)的利鈉、利尿、擴(kuò)張血管和降低血壓的作用。在調(diào)節(jié)體液容量和濃度、控制血壓、維持體液平衡方面起著重要作用、可作為降血壓藥和利尿藥，用于治療充血性心臟衰竭、高血壓、腎功能衰竭、水腫和氣喘等疾病。第三章基因工程制藥人的心鈉素基因(化學(xué)合成)已先后在大腸桿菌、酵母菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到表達(dá)。1986年．VlasukIs等已將化學(xué)合成的人心鈉素24肽(128-151)基因成功地在酵母細(xì)胞中獲得表達(dá)。而且表達(dá)產(chǎn)物可分泌到培養(yǎng)液中。我國也已成功地將人α心鈉素基因克隆到酵母分泌性表達(dá)載體中，并獲得高效表達(dá)，

95％以上的產(chǎn)物被分泌到培養(yǎng)液中。第三章基因工程制藥

8．重組乙肝疫苗重組乙肝疫苗是以基因工程技術(shù)研制的第2代乙型肝炎（HB）疫苗，已獲得了突破性和實(shí)用性進(jìn)展，是基因工程疫苗中最成功的例子。目前，乙肝病毒(HBV)基因在真核細(xì)胞中表達(dá)已出現(xiàn)了4條途徑：(1)將HBV的S、S2或S1基因重組質(zhì)