南開大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)第五講-2-核酸-蛋白質(zhì)的相互作用研究方法的新進(jìn)展

生物大分子的相互作用生物大分子發(fā)揮生理功能所需的三個(gè)條件：分子結(jié)構(gòu)、分子運(yùn)動(dòng)和變化以及分子間的相互作用。一、生物大分子相互作用的力：1.非共價(jià)鍵的作用；2.分子的結(jié)合與解離；二、蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用：1.蛋白質(zhì)的模體與結(jié)構(gòu)域2.蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)3.蛋白質(zhì)之間相互作用的特異性三、DNA—蛋白質(zhì)相互作用：（一）化學(xué)鍵：

1.氫鍵

2.疏水鍵

3.離子鍵（二）DNA—蛋白質(zhì)相互作用中的序列特異識(shí)別：1.序列特異識(shí)別的結(jié)合能2.序列特異結(jié)合的機(jī)構(gòu)基元核酸/蛋白質(zhì)相互作用研究方法

的新進(jìn)展

蛋白質(zhì)和核酸是構(gòu)成生命體最為重要的兩類生物大分子，蛋白質(zhì)與核酸的相互作用是分子生物學(xué)研究的中心問題之一，它是許多生命活動(dòng)的重要組成部分。研究蛋白質(zhì)/核酸相互作用近期采用的新技術(shù)有：1.核酸適體技術(shù)、2.生物信息學(xué)方法、3.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)以及4.納米技術(shù)等。蛋白質(zhì)和核酸是構(gòu)成生命體最為重要的兩類生物大分子。蛋白質(zhì)與核酸的相互作用是分子生物學(xué)研究的中心問題之一，它是許多生命活動(dòng)的重要組成部分。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，大量基因被發(fā)現(xiàn)和定位，基因的功能問題將成為今后研究的熱點(diǎn)。大多數(shù)基因的最終產(chǎn)物是相應(yīng)的蛋白質(zhì)，因此要認(rèn)識(shí)基因的功能，必然要研究基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的功能往往體現(xiàn)在與其他蛋白質(zhì)及(或)核酸的相互作用之中。細(xì)胞各種重要的生理過程，包括信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境及內(nèi)環(huán)境變化的反應(yīng)等，都是以蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)的相互作用為紐帶。所以，近年來(lái)，蛋白質(zhì)間相互作用以及蛋白質(zhì)/核酸相互作用的研究逐漸得到重視。對(duì)于蛋白質(zhì)和核酸的相互作用，李英賢和賀福初[1]、呂鑒泉和龐代文[2]對(duì)經(jīng)典生物化學(xué)和物理化學(xué)的研究方法進(jìn)行了綜述。1核酸適體技術(shù)核酸適體(aptamer)指的是經(jīng)過一種新的體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematicevo196生命科學(xué)第18卷lutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)，從隨機(jī)單鏈寡聚核苷酸文庫(kù)中得到的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸，可以是RNA也可以是DNA，長(zhǎng)度一般為25~60個(gè)核苷酸。SELEX的篩選流程首先是利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)人工合成一個(gè)含有1014~1015個(gè)單鏈寡核苷酸序列的隨機(jī)文庫(kù)，序列長(zhǎng)度往往在25~35個(gè)核苷酸之間，單鏈的隨機(jī)寡核苷酸序列容易形成可與蛋白質(zhì)等配體特異性共價(jià)結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在這一高親和力特異性結(jié)合的基礎(chǔ)之上配體蛋白質(zhì)同隨機(jī)文庫(kù)相互作用，選擇性分離出核酸適體后，然后通過PCR或RT-PCR等技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。次一級(jí)文庫(kù)再與配體蛋白質(zhì)相互作用，反復(fù)多次循環(huán)，即可獲得與配體蛋白質(zhì)特異性高親和力結(jié)合的核酸適體。核酸適體與配體間的親合力(解離常數(shù)在皮摩和納摩之間)常要強(qiáng)于抗原抗體之間的親合力[3]。核酸適體所結(jié)合的靶分子范圍非常廣泛，除蛋白質(zhì)之外，還能作用于酶、生長(zhǎng)因子、抗體、基因調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞黏附分子、植物凝集素、完整的病毒顆粒、病原菌等[4]。適體從20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)以后，就得到了科研工作者的廣泛關(guān)注，適體的研究工作得到了快速的發(fā)展。SELEX篩選技術(shù)和核酸適體的高親和性在蛋白質(zhì)/核酸相互作用的研究中發(fā)揮了重要的作用。Wen等[5]研究了同細(xì)菌噬菌體Ff基因5蛋白(g5p)高親和力結(jié)合的核酸適體，發(fā)現(xiàn)G富集基序?qū)τ谛纬蒰5p連接啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，提供實(shí)際的g5p連接位點(diǎn)具有重要的意義。White等[6]利用SELEX技術(shù)研究了一種PUM2HD(短小桿菌素同源結(jié)構(gòu)域)及其RNA核酸適體，發(fā)現(xiàn)在PUM2氨基端有Ser和Glu/Ala富集區(qū)，并且PEB(PUM2連接元件)與果蠅反應(yīng)元件的3‘端具有親緣關(guān)系，但又互不相同。Bouvent

等[7]利用NRE(核仁蛋白識(shí)別元件)發(fā)現(xiàn)了RNA莖環(huán)上的RBD1和RBD2(折疊元件結(jié)構(gòu)域)，這對(duì)了解模式蛋白識(shí)別RNA的結(jié)構(gòu)過程具有重要意義。核酸適體以及SELEX技術(shù)給蛋白質(zhì)/核酸相互作用研究提供了一種新穎的研究方法，科研人員可以控制篩選條件得到與待研究蛋白質(zhì)相互結(jié)合的核酸適體，避免了天然條件下研究蛋白質(zhì)/核酸相互作用的困難性。但目前對(duì)核酸適體與靶蛋白相互作用的分析是在篩選條件與天然條件相同的假設(shè)基礎(chǔ)上進(jìn)行的，在這種篩選條件下得到的核酸適體與蛋白質(zhì)之間的相互作用，和天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)/核酸之間的相互作用到底有何異同，這是一個(gè)亟待解決的問題，此問題的解決必將推動(dòng)蛋白質(zhì)/核酸相互作用的研究進(jìn)展。2生物信息學(xué)方法生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)。它包含著生物信息的獲取、處理、存儲(chǔ)、分配、分析和解釋的所有方面。具體地說(shuō)，生物信息學(xué)是用數(shù)理和信息科學(xué)的觀點(diǎn)、理論和方法去研究生命現(xiàn)象，組織和分析呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)的生物學(xué)數(shù)據(jù)的一門學(xué)科。Luscombe

和Thornton[8]利用氨基酸序列的保守性構(gòu)建計(jì)算機(jī)算法來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)/DNA復(fù)合體中DNA的結(jié)合位點(diǎn)。Selvaraj

等[9]將蛋白質(zhì)/核酸復(fù)合體中原子電荷勢(shì)能作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，利用人工智能技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)對(duì)DNA的識(shí)別位點(diǎn)。Ahmad等[10]將蛋白質(zhì)的序列組成、可溶解性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等信息數(shù)據(jù)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法進(jìn)行訓(xùn)練，構(gòu)建了在線蛋白質(zhì)/核酸結(jié)合預(yù)測(cè)技術(shù)，預(yù)測(cè)成功率達(dá)到了69%。此后Ahmad和Sarai[11]將此技術(shù)進(jìn)一步加強(qiáng)，在訓(xùn)練人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)時(shí)加入了蛋白質(zhì)進(jìn)化關(guān)系的信息，使預(yù)測(cè)成功率提高了8.7%。目前建立在蛋白質(zhì)/核酸相互作用基礎(chǔ)上的較重要的數(shù)據(jù)庫(kù)為蛋白質(zhì)-核酸識(shí)別數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gibk26.bse.kyutech.ac.jp/jouhou/3dinsight/recognition.html)，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)能幫助研究者了解核酸被蛋白質(zhì)識(shí)別的機(jī)制。該數(shù)據(jù)庫(kù)包括以下幾個(gè)組成部分。2.1蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)包含蛋白質(zhì)-核酸復(fù)合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)。這些數(shù)據(jù)根據(jù)蛋白質(zhì)的識(shí)別序列和復(fù)合物中DNA形式進(jìn)行分類。使用者可以通過關(guān)鍵詞、識(shí)別序列、DNA形式等進(jìn)行搜索，并且搜索結(jié)果可以直接鏈接到3DinSight數(shù)據(jù)庫(kù)(在此處，可以通過三維結(jié)構(gòu)瀏覽器，如RasMol

或者VRML查看含有序列位點(diǎn)和突變位點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)圖)。該數(shù)據(jù)庫(kù)也能讓使用者檢測(cè)依賴于序列的構(gòu)象參數(shù)和DNA的柔韌性，并以圖表形式顯示結(jié)果。2.2核苷酸-氨基酸相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)核苷酸-氨基酸相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)搜集核苷酸和氨基酸間4埃大小內(nèi)的成對(duì)原子，能讓使用者找到成對(duì)的核苷酸和氨基酸。使用者可以指定殘基名稱(核苷酸或氨基酸)、原子類型和側(cè)鏈/骨干。搜索后，帶有距離值的所有原子對(duì)將被顯示。搜索可直接鏈接到3DinSight數(shù)據(jù)庫(kù)，以RasMol

圖片形式自動(dòng)地突出展示復(fù)合物結(jié)構(gòu)中所有原子對(duì)。使用者可以檢測(cè)到第2期王成剛，等：蛋白質(zhì)/核酸相互作用研究方法進(jìn)展197每個(gè)結(jié)構(gòu)中核苷酸和氨基酸的特別相互作用。2.3蛋白質(zhì)-核酸相互作用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(ProNIT)蛋白質(zhì)-核酸相互作用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)包含有序列、結(jié)構(gòu)和一些熱力學(xué)參量(如分裂常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、吉布斯自由能的轉(zhuǎn)換、焓和熱容量、活性)等信息。該數(shù)據(jù)庫(kù)允許使用者用不同條件(多種分類和顯示選項(xiàng))搜索數(shù)據(jù)。此外，ProNIT

超鏈接于其他重要的數(shù)據(jù)庫(kù)，如PDB、核酸數(shù)據(jù)庫(kù)NDB、酶代碼EC、蛋白質(zhì)信息資源PIR和ProTherm等等。當(dāng)前，在分子生物學(xué)和信息科學(xué)快速發(fā)展的影響下，生物信息學(xué)已經(jīng)成為生物領(lǐng)域的指導(dǎo)科學(xué)，利用生物信息學(xué)方法研究蛋白質(zhì)/核酸相互作用可以大大縮短研究工作的時(shí)間，達(dá)到事半功倍的效果。但受限于當(dāng)前計(jì)算科學(xué)和算法領(lǐng)域的發(fā)展情況，生物信息學(xué)得到的結(jié)果與實(shí)際的結(jié)果還存在一定的偏差，仍需開展進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)工作來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。3生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)是基于生物大分子間相互作用的大規(guī)模并行分析方法，使得生命科學(xué)研究中所涉及的樣品反應(yīng)、檢測(cè)、分析等過程得以連續(xù)化、集成化和微型化，現(xiàn)已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)展最快的技術(shù)之一。目前的生物芯片主要有核酸芯片、蛋白質(zhì)芯片和糖體芯片等幾大類。蛋白質(zhì)芯片是依靠手工、壓印或噴墨的方法將探針蛋白點(diǎn)樣在化學(xué)膜、凝膠、微孔板或玻片上形成陣列，經(jīng)過與樣品的雜交捕獲靶蛋白，再用原子力顯微鏡、磷光成像儀、光密度儀或激光共聚焦掃描儀進(jìn)行檢測(cè)，獲得靶蛋白表達(dá)的種類、數(shù)量及關(guān)聯(lián)等信息。蛋白質(zhì)芯片已經(jīng)廣泛用于研究蛋白質(zhì)與核酸的相互作用，已成為一種進(jìn)行高通量蛋白質(zhì)與DNA或RNA作用篩選的有效方法。Ge[12]運(yùn)用蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)蛋白質(zhì)與核酸相互作用，他將包括通用轉(zhuǎn)錄因子、激活蛋白和輔激活蛋白在內(nèi)的48種純化蛋白質(zhì)點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜制成通用蛋白質(zhì)芯片，用腺病毒主要晚期啟動(dòng)子64bp

雙鏈DNA片段、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子64bp負(fù)鏈DNA和SV40早期前體mRNA雜交，結(jié)果證明蛋白質(zhì)芯片上的所有蛋白質(zhì)都能夠不同程度地特異性識(shí)別和結(jié)合雙鏈和單鏈寡核苷酸片段，并且結(jié)合雙鏈DNA和單鏈DNA的總體模式基本相同，說(shuō)明大多數(shù)DNA結(jié)合蛋白既能和雙鏈DNA結(jié)合，也能夠和單鏈DNA結(jié)合。蛋白質(zhì)芯片與RNA的作用研究表明，蛋白質(zhì)芯片能夠成功地分析RNA與蛋白質(zhì)間的識(shí)別性結(jié)合。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)最大優(yōu)點(diǎn)在于快速和高通量，以往科研人員作研究時(shí)一次只能研究少量生物樣品，借助蛋白質(zhì)芯片，一次實(shí)驗(yàn)可同時(shí)研究大量生物樣本，加速了蛋白質(zhì)/核酸相互作用的研究。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)目前存在的問題有：(1)蛋白質(zhì)芯片在制作過程中實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生微小的變化便可能引起最后結(jié)果的不同，實(shí)驗(yàn)條件不易控制，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性相對(duì)不足；(2)目前用于蛋白質(zhì)芯片制備的固相介質(zhì)，如化學(xué)膜、凝膠和玻片都存在一些缺點(diǎn)，蛋白質(zhì)在固相基質(zhì)表面的固定往往會(huì)造成其解折疊，從而失去生物活性；(3)對(duì)結(jié)果的掃描、去除背景、數(shù)據(jù)處理等，目前還不能做得很完美，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性、假陰性的存在。4納米技術(shù)納米技術(shù)(nanoscaletechnology)是一門在0.1~100nm空間尺度內(nèi)操縱原子和分子，對(duì)材料進(jìn)行加工、制造具有特定功能的產(chǎn)品、或?qū)δ澄镔|(zhì)進(jìn)行研究，掌握其原子和分子的運(yùn)動(dòng)規(guī)律和特性的嶄新高技術(shù)學(xué)科。核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的大小也是在納米尺度，隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的納米技術(shù)被用來(lái)研究生物大分子。在蛋白質(zhì)/核酸相互作用的研究工作中，目前使用較新的技術(shù)是利用納米孔技術(shù)來(lái)進(jìn)行研究。納米孔(nanopore)，可以簡(jiǎn)單地定義為內(nèi)徑為1~100nm的微小洞孔，一般孔徑應(yīng)大于洞孔深度，或者處于同一量級(jí)。如果孔的深度遠(yuǎn)大于孔徑，就稱之為納米孔道。納米孔有天然存在的生物納米孔，也有人工加工的納米孔[13~15]。它們都可以用來(lái)進(jìn)行生命科學(xué)的相關(guān)研究，但是，理想的生物化學(xué)或生物物理研究應(yīng)采用孔徑穩(wěn)定、堅(jiān)固耐用、物化性能良好的固體納米孔，這樣的納米孔應(yīng)該由質(zhì)地堅(jiān)硬的固體薄膜材料加工制作。Li等[16]利用聚焦離子束(FIB)制作納米孔，利用納米孔將雙螺旋DNA從組蛋白八聚體上剝離下來(lái)，并探測(cè)這一過程，從而可以揭示核小體中包含的許多生物化學(xué)、物理信息。這是由于處于電場(chǎng)中的核小體在電場(chǎng)的作用下，DNA分子穿越納米孔，同時(shí)由于納米孔的阻擋力，使組蛋白不能穿越，從而誘使DNA從組蛋白八聚體上分離下來(lái)。通過準(zhǔn)確檢測(cè)DNA分子穿孔過程中引起的電流阻塞效應(yīng)，可將DNA與組蛋白的相互作用的一些性質(zhì)反映出來(lái)。目前已經(jīng)取得了階段性的成果。在納米尺度上研究核酸與蛋白質(zhì)相互作用，相較于其他的研究方法，優(yōu)點(diǎn)是能夠在生物活性環(huán)境198生命科學(xué)第18卷中，保持生物大分子受到最少化學(xué)修飾干擾的狀態(tài)下，對(duì)生物大分子的空間結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)變化、生化特性等進(jìn)行直接研究。相信該技術(shù)可以提供更多、更詳細(xì)的生物大分子相互作用、蛋白質(zhì)功能等方面的信息，幫助我們解決一些深層次的生物學(xué)疑難問題。目前阻礙此方法廣泛應(yīng)用的一個(gè)最大難題是如何在納米尺度上更好的操縱生物大分子，這需要生物科學(xué)、電子科學(xué)、材料科學(xué)等多學(xué)科的共同進(jìn)展來(lái)推動(dòng)此方法的發(fā)展和應(yīng)用。5結(jié)語(yǔ)自然界的生物學(xué)過程是通過生物體內(nèi)各種大分子之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，揭開蛋白質(zhì)/核酸相互作用的規(guī)律，有助于加深人類對(duì)生命現(xiàn)象本質(zhì)的理解。目前對(duì)于蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究已經(jīng)取得了一定的研究成果，但仍有許多問題有待解決。進(jìn)一步研究其相互作用需要生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)及電子學(xué)等多學(xué)科的協(xié)作，隨著各種新技術(shù)在這個(gè)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，人類一定能在不遠(yuǎn)的將來(lái)揭開蛋白質(zhì)與核酸相互作用的規(guī)律。[參考文獻(xiàn)][1]李英賢,賀福初.DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究方法.生命的化學(xué),2003,23(4):306~308[2]呂鑒泉,龐代文.核酸與蛋白質(zhì)相互作用研究的新技術(shù)與新方法.化學(xué)進(jìn)展,2004,16(3):393~399[3]JiangYX,ZhuCF,LingLS,etal.Specificaptamer-proteininteractionstudiedbyatomicforcemicroscopy.AnalChem,2003,75(9):2112~2116[4]LeeJF,HesselberthJR,MeyersLA,etal.Aptamer

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