檸檬明串珠菌D-乳酸脫氫酶在大腸桿菌中的表達(dá)

檸檬明串珠菌檸檬明串珠菌D-乳酸脫氫酶在大腸桿菌中的表達(dá)

摘要為高效表達(dá)檸檬明串珠菌D-乳酸脫氫酶，培養(yǎng)含檸檬明串珠菌D-乳酸脫氫酶重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)，但該外源基因只有在誘導(dǎo)劑的作用下才能正常表達(dá)，因此，本研究通過(guò)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷作為誘導(dǎo)劑，通過(guò)SDS分析其表達(dá)量，探究不同誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間與IPTG濃度對(duì)D-乳酸脫氫酶的影響，確定最優(yōu)表達(dá)條件；采用鎳柱親和層析的方法進(jìn)行酶的純化，對(duì)純化酶采用聚乙二醇填埋法濃縮，達(dá)到純化濃縮D-乳酸脫氫酶的目的。結(jié)果表明：誘導(dǎo)溫度為20℃、誘導(dǎo)時(shí)間為16h、誘導(dǎo)IPTG濃度為0.5mM時(shí)，D-乳酸脫氫酶的表達(dá)量最高；對(duì)純化后的酶液使用聚乙二醇填埋法濃縮過(guò)夜后，所得上清目的蛋白量增多。本研究為高效表達(dá)檸檬明串珠菌D-乳酸脫氫酶提供理論支持，對(duì)食品工業(yè)和醫(yī)藥保健等領(lǐng)域應(yīng)用有重要意義。關(guān)鍵詞：D-乳酸脫氫酶；檸檬明串珠菌；IPTG誘導(dǎo)；SDS凝膠電泳；純化濃縮

目錄TOC\o"1-3"\h\u引言 材料與方法實(shí)驗(yàn)材料與儀器試驗(yàn)菌株表達(dá)了檸檬明串珠菌KM20D-乳酸脫氫酶重組質(zhì)粒的大腸桿菌為延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食品與生物科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室的保存菌株。主要試劑LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、PBS緩沖液、卡那霉素、HCl、Na2HPO4、KH2PO4、咪唑、尿素、Tris-Base、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甲醇、乙酸、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS)凝膠制備試劑盒、考馬斯亮藍(lán)R-250，購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；NaCl、KCl、乙醇，購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。表1-1溶液配制表Tab.1-1Preparationofsolution溶液名稱成分pH其他緩沖液A（平衡液）PBS緩沖液HCl調(diào)節(jié)pH為7.4高壓滅菌4℃保存緩沖液B144g尿素，1.8gTris-HCl，5.26NaCl，300mL蒸餾水HCl調(diào)節(jié)pH為8高壓滅菌4℃保存洗雜液A30mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液HCl調(diào)節(jié)pH為7.4高壓滅菌4℃保存洗雜液B50mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液HCl調(diào)節(jié)pH為7.4高壓滅菌4℃保存洗脫液500mmol/L咪唑，500mmol/LNaCl，20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液HCl調(diào)節(jié)pH為7.4高壓滅菌4℃保存IPTG(100mM)2.4gIPTG，100mL滅菌水--20℃貯存卡那霉素(30mg/ml)30g卡那霉素，100mL滅菌水--20℃貯存注：表中“-”表示無(wú)需調(diào)節(jié)該溶液的pH值，所有溶液均需0.22μm過(guò)濾膜過(guò)濾。儀器與設(shè)備表1-2儀器與設(shè)備Tab.1-2Instrumentsandequipment名稱廠家型號(hào)超聲波細(xì)胞破碎儀杭州米歐儀器有限公司UCS-650雷磁pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司PHS-3C超低溫冰箱美國(guó)NUAIRE公司NU-9668E超凈工作臺(tái)上海新苗醫(yī)療器械機(jī)械制造有限公司SW-CJ-IFD電熱恒溫培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療設(shè)備有限公司DNP-9082BS-Ⅲ高壓蒸汽滅菌器日本TOMY公司SX-700冷凍離心機(jī)萊比信(中國(guó))科技發(fā)展有限公司Z400KSDS電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司1658001電子分析天平上海天平儀器有限公司FA1104恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司ZWY-100H/240恒流泵上海精科實(shí)業(yè)有限公司HL-2Ni2+-NTA柱瑞典GEHealthcare公司1658001透析袋美國(guó)VISKASE公司MD4416實(shí)驗(yàn)方法檸檬明串珠菌D-乳酸脫氫酶的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化依照張英龍等人REF_Ref15288\r\h[15]的方法，修改如下：挑取單克隆菌落在LB固體培養(yǎng)基上劃線，在37℃條件下恒溫過(guò)夜培養(yǎng)。隨后在固體培養(yǎng)基上挑取單一菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)活化，并于37℃、180rmp下恒溫振蕩12h，然后按1:50的比例將菌液接種至100mL的LB液體培養(yǎng)基中。當(dāng)OD600值達(dá)到0.6時(shí)，在IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5mM，分別在37℃與20℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，通過(guò)SDS分析最適誘導(dǎo)溫度；在最適誘導(dǎo)溫度條件下，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5mM，分別誘導(dǎo)培養(yǎng)4h、8h、12h、16h，通過(guò)SDS分析最適誘導(dǎo)時(shí)間；在最適誘導(dǎo)溫度和最適誘導(dǎo)時(shí)間條件下，IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.25mM、0.5mM、0.75mM、1mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)16h，通過(guò)SDS分析最適誘導(dǎo)濃度REF_Ref15327\r\h[16]。在活化菌株時(shí)，由于構(gòu)建大腸桿菌質(zhì)粒時(shí)卡那霉素抗性基因連接至終載，所以向LB培養(yǎng)基中加入卡那霉素（30μg/mL），可以去除雜菌得到相應(yīng)菌種。D-乳酸脫氫酶粗酶液的制備收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液，于4000r/min下離心10min，棄上清，收集菌體并按25:2的比例加入緩沖液A混勻，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體細(xì)胞，破碎時(shí)間為15min（開5S，關(guān)5S），破碎過(guò)程采用冰浴方法，制造低溫環(huán)境，保證酶活力。破碎后所得D-乳酸脫氫酶粗酶液。將粗酶液用冷凍離心機(jī)在4℃下、12000r/min離心5min，分別收集上清蛋白與沉淀，并按照1:1的比例向沉淀中加入緩沖液B裂解菌體，4℃保存。D-乳酸脫氫酶的純化濃縮根據(jù)IPTG誘導(dǎo)結(jié)果，選擇最優(yōu)的表達(dá)條件，并按1.2.1與1.2.2的步驟，制備上清樣粗蛋白樣液。純化上清樣時(shí)，向?qū)游鲋屑尤?倍柱床體積的緩沖溶液A，清洗并平衡層析柱。通過(guò)恒流泵將上清粗蛋白樣液流穿層析柱，用離心管接住流穿液，反復(fù)上柱3次。根據(jù)蛋白His標(biāo)簽D-乳酸脫氫酶純化時(shí)采用Ni2+親和層析法，多次反復(fù)上樣能使上清樣中的粗蛋白與Ni2+-NTA柱填料充分結(jié)合。隨后，先用洗雜液A和洗雜液B進(jìn)行兩次洗雜，再經(jīng)過(guò)洗脫液緩慢進(jìn)行洗脫，收集洗脫流穿液REF_Ref15373\r\h[17]作為純酶液在4℃下進(jìn)行保存。取20mL純化后的酶液裝入透析袋中，透析袋埋在聚乙二醇中濃縮過(guò)夜。SDS檢測(cè)方法對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化以及純化濃縮后的結(jié)果進(jìn)行SDS檢測(cè)，具體操作如下。裝板用密封硅膠框?qū)夹筒Ａc平玻璃夾住，并垂直放入玻璃膠室內(nèi)，即可灌膠。制膠按表1-3中溶液的順序及比例制備凝膠，分別配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。表1-3SDS凝膠制備Tab.1-3PreparationofSDSgels試劑名稱12%分離膠5%濃縮膠總體積10mL5mL30%制膠液(29:1)4mL0.83mL1MTris-HCL(pH6.8)0mL0.625mL1.5MTris-HCL(pH8.8)2.5mL010%SDS100μL50μLddH2O3.3mL3.42mL10%PAGE膠凝固劑100μL75μLPAGE膠促凝劑10μL7.5μL最佳分離范圍12-60kD-上膠將配好的12%分離膠溶液緩慢加入制膠板之間REF_Ref15422\r\h[18],待分離膠距短玻璃上沿2cm處停止加入，用移液槍貼近膠液界面加入蒸餾水,以防止溶液蒸發(fā)并保證膠面平整,待分離膠聚合后倒去水層用濾紙吸去殘液。用移液槍將制備好5%濃縮膠溶液加在分離膠面上,充滿制膠板，插入樣品梳REF_Ref15422\r\h[18]。樣品處理將10×LoadingBuffer稀釋至2×LoadingBuffer并分別與上清樣、沉淀樣等體積混合，在沸水中煮5min后冷卻至室溫備用。上樣將預(yù)制膠放入電泳槽中，并灌入新配置的電泳緩沖液，外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可，注意避免電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡，待緩沖液浸過(guò)加樣口后小心拔出梳子，防止加樣口變形。用移液槍注入Marker5μL，上清樣和沉淀樣分別注入10μLREF_Ref15494\r\h[19]。電泳上樣完畢蓋上蓋子，先將電壓設(shè)置為80V，樣品進(jìn)入分離膠與濃縮膠的臨界處時(shí)，將電壓變?yōu)?20V。當(dāng)樣液移動(dòng)至距離玻璃底端0.5～1cm處停止電泳，在電泳過(guò)程中保持電流穩(wěn)定。染色、脫色電泳結(jié)束后關(guān)閉電源，將2塊玻璃板取出，用刀片輕輕插入凹槽玻璃的頂部與另一玻璃板之間的縫隙，輕輕向上撬，上層玻璃輕輕撬開進(jìn)行剝膠[20]。使用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液在室溫下染色1h，用蒸餾水脫色至背景無(wú)色后將凝膠平整放置于玻璃板上，拍照掃描條帶REF_Ref15494\r\h[19]。結(jié)果與分析不同誘導(dǎo)溫度對(duì)D-乳酸脫氫酶表達(dá)條件的影響M:蛋白標(biāo)樣；1：37℃時(shí)粗酶樣液；2：37℃是上清樣；3：37℃是沉淀樣；4：20℃時(shí)粗酶樣液；5：20℃時(shí)上清樣；6：20℃時(shí)沉淀樣圖2-1SDS分析IPTG不同溫度下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)Fig.2-1SDSanalysisIPTGinducedproteinexpressionatdifferenttemperature將兩種樣本置于IPTG濃度為0.5mM環(huán)境中，分別誘導(dǎo)表達(dá)8h進(jìn)行比較。如圖2-1所示，蛋白表達(dá)量經(jīng)過(guò)SDS電泳分析顯示，約為40kDa處有明顯的特異蛋白條帶。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為20℃時(shí)，粗酶、上清樣、沉淀樣誘導(dǎo)的表達(dá)量整體比37℃誘導(dǎo)的表達(dá)量更多。因此，誘導(dǎo)溫度為20℃時(shí)表達(dá)效果最佳。根據(jù)邱昱REF_Ref15572\r\h[21]等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D-乳酸脫氫酶在降低溫度誘導(dǎo)時(shí)，由于菌體轉(zhuǎn)錄翻譯的速度有所減慢，導(dǎo)致可以形成更多正確折疊構(gòu)象的蛋白，這一現(xiàn)象促進(jìn)了D-乳酸脫氫酶的可溶性表達(dá)，且在20℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)出的D-乳酸脫氫酶主要以可溶性形式存在。不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)D-乳酸脫氫酶表達(dá)條件的影響M：蛋白標(biāo)樣；1：誘導(dǎo)4h的上清樣；2：誘導(dǎo)8h的上清樣；3：誘導(dǎo)12h的上清樣；4：誘導(dǎo)16h的上清樣圖2-2SDS分析IPTG不同時(shí)間下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)Fig.2-2SDSanalysisIPTGinducedproteinexpressionatdifferenttime由于沉淀蛋白是由于錯(cuò)誤折疊所致，不能表達(dá)活性，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)只對(duì)上清蛋白表達(dá)條件優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。選擇最優(yōu)誘導(dǎo)溫度20℃，在IPTG濃度為0.5mM環(huán)境下，對(duì)不同的誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行比較。如圖2-2所示，蛋白表達(dá)量經(jīng)過(guò)SDS電泳分析顯示，約為40kDa處有明顯的特異蛋白條帶。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，該酶的表達(dá)量也隨之增加，該時(shí)間段內(nèi)其誘導(dǎo)表達(dá)效果與誘導(dǎo)時(shí)間呈正相關(guān)，16h后該菌株由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入衰老期，其誘導(dǎo)效果隨之降低。因此，誘導(dǎo)時(shí)間為16h時(shí)表達(dá)效果最佳。根據(jù)研究結(jié)果表明REF_Ref15618\r\h[22]，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組蛋白酶可溶性表達(dá)量增加。不同誘導(dǎo)濃度對(duì)D-乳酸脫氫酶表達(dá)條件的影響M:蛋白標(biāo)樣；1:IPTG濃度0.25mM的上清樣；2:IPTG濃度0.2mM時(shí)的上清樣與沉淀樣；3:IPTG濃度0.75mM時(shí)的上清樣；4:IPTG濃度1.0mM時(shí)的上清樣圖2-3SDS分析IPTG不同濃度下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)Fig.2-3SDSanalysisIPTGinducedproteinexpressionatdifferentconcentrations選擇最佳誘導(dǎo)溫度20℃、最佳誘導(dǎo)時(shí)間16h，對(duì)不同的誘導(dǎo)濃度進(jìn)行比較。如圖2-3所示，蛋白表達(dá)量經(jīng)過(guò)SDS電泳分析顯示，約為40kDa處有明顯的特異蛋白條帶。各濃度之間進(jìn)行相比，誘導(dǎo)劑濃度為0.5mM其誘導(dǎo)效果好于其他組，且濃度為0.5mM時(shí)沉淀量最多。因此，誘導(dǎo)濃度為0.5mM時(shí)表達(dá)效果最佳。在邱昱REF_Ref15572\r\h[21]等優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也表明，在低濃度條件下誘導(dǎo)時(shí)，重組蛋白酶主要以可溶性形式存在，當(dāng)用較高誘導(dǎo)時(shí)，重組蛋白酶主要以包涵體的形式存在，且在0.5mM時(shí)D-乳酸脫氫酶以可溶性形式存在最多，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。檸檬明串珠菌D-乳酸脫氫酶濃縮結(jié)果M：蛋白標(biāo)樣;1：濃縮上清樣;2：濃縮沉淀樣圖2-4SDS分析濃縮蛋白表達(dá)Fig.2-4ExpressionofproteinconcentratebySDS由圖2-4可知，蛋白表達(dá)量經(jīng)過(guò)SDS電泳分析顯示，約為40kDa處有明顯的特異蛋白條帶。20ml純酶液經(jīng)透析過(guò)夜后所得純化濃縮酶液約為0.5ml，經(jīng)SDS電泳分析結(jié)果顯示目的蛋白含量明顯增加，濃縮成功，目的蛋白其水溶性得到了提高。結(jié)論在IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌中檸檬明串珠菌D-乳酸脫氫酶表達(dá)時(shí)，探索出最優(yōu)誘導(dǎo)溫度為20℃、最優(yōu)誘導(dǎo)時(shí)間為16h、最優(yōu)誘導(dǎo)濃度為0.5mM。檸檬明串珠菌D-乳酸脫氫酶經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，采用Ni2+-NTA柱親和層析法進(jìn)行純化，純化后的菌液經(jīng)聚乙二醇填埋法濃縮后，D-乳酸脫氫酶含量有所增加，上清樣中的蛋白表達(dá)量明顯增加，其水溶性增加。參考文獻(xiàn)CHUNBH,KIMKH,JEONHH,etal.Pan-genomicandtranscriptomicanalysesofleuconostocmesenteroidesprovideinsightsintoitsgenomicandmetabolicfeaturesandrolesinkimchifermentation[J].ScientificReports,2017,7(1):118-119.盧宏皓,劉昭明,黃翠姬,楊忠平,虞珂娜,張開翼.檸檬明串珠菌接種發(fā)酵竹筍過(guò)程中的化學(xué)成分變化[J].食品科技,2021,46(07):87-93.DOI:10.13684/ki.spkj.2021.07.015.CHOIIK,JUNGSH,KIMBJ,etal.NovelLeuconostoccitreumstarterculturesystemforthefermentationofkimchi,afermentedcabbageproduct[J].AntonieVanLeeuwenhoekInternationalJournalofGeneralandMolecularMicrobiology,2003,84(4):247-253CHOIYJ,YONGS,LEEMJ,etal.Changesinvolatileandnon-volatilecompoundsofmodelkimchithroughfermentationbylacticacidbacteria[J].LWT-FoodScienceandTechnology,2019,105:118-126.韓瑨,劉振民,郭本恒,吳正鈞.檸檬明串珠菌的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2014,35(16):126-131.鄭毅男,劉可越,徐寶軍,韓立坤.桔?？狗逝謾C(jī)理試驗(yàn)研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,24(6):42-53華東理工大學(xué).粘質(zhì)沙雷氏菌D-乳酸脫氫酶基因,克隆、表達(dá)重組菌株及重組酶的研究:CN200910054467.3[P].2011-01-12.錢國(guó)軍,陳彩平,翟如英,邵蔚藍(lán),梅艷珍.極耐熱性乳酸脫氫酶高效表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].生物工程學(xué)報(bào),2014,30(04):545-553.DOI:10.13345/j.cjb.130456.SIMONES,PLANTER,WHITESIDESGM.D-lactatedehydrogenase.Substratespecificityanduseasacatalystinthesynthesisofhomochiral2-hydroxyacids[J].Appliedbiochemistryandbiotechnology,1989,22(2):169-179.袁劍,秦浩,葛向陽(yáng),張偉國(guó).干酪乳桿菌L-乳酸脫氫酶在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)通報(bào),2011,38(10):1482-1487.DOI:10.13344/j.microbiol.china.2011.10.026.汪多仁.L-乳酸的開發(fā)與應(yīng)用進(jìn)展[J].飲料工業(yè),2008(02):11-18.劉鵬,李爽,賈曉強(qiáng),聞建平,財(cái)音青格樂(lè).基因工程菌生產(chǎn)D-乳酸研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工,2010,30(10):13-17+19.DOI:10.16606/ki.issn0253-4320.2010.10.001.宋嘉寧,黃志兵,劉珞,譚天偉.肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脫氫酶基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,39(02):79-83.莫征杰.植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶的異源表達(dá)及條件優(yōu)化[D].浙江大學(xué),2014.李卓.人源性抗?jié)h灘病毒中和活性抗體的制備和鑒定[D].第四軍醫(yī)大學(xué),2017.張英龍.德式乳桿菌D-乳酸脫氫酶基因的克隆與表達(dá)[J].南方農(nóng)機(jī),2017,48(22):70-72.BERWALR，GOPALANN,CHANDELK,etal.Plasmodiumfalciparum:Enhancedsolubleexpression,purific