《微生物發(fā)酵技術(shù)》-項(xiàng)目九 典型發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)

發(fā)酵技術(shù)項(xiàng)目九典型發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)紅葡萄酒釀造工藝01一、紅葡萄酒釀造工藝葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成的、含有一定酒精度的發(fā)酵酒（GB15037-2006）。1.原料一、紅葡萄酒釀造工藝紅葡萄酒：色澤濃艷、香味濃；含糖量：22%-36%；含酸量：4.0-7.0g/L葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis）釀酒葡萄有70多種，我國(guó)約有35種。三分工藝七分原料2.紅葡萄酒釀造工藝流程一、紅葡萄酒釀造工藝一、紅葡萄酒釀造工藝除梗：葡萄梗單寧較強(qiáng)勁，要除去；破碎：每粒葡萄都要破碎，籽梗不能壓碎，皮不能壓扁；不得與鐵銅等金屬接觸；壓榨：紅葡萄酒直接榨汁，帶皮發(fā)酵。（1）除梗及破碎一、紅葡萄酒釀造工藝（2）SO2的添加SO2的作用：殺菌、澄清、抗氧化、增酸、可溶解果皮中色素和無機(jī)鹽等成分以及除醛等；添加量：葡萄重量的0.005～0.006%；添加形式：①6%-8%亞硫酸水溶液；②直接通入SO2氣體；③固體焦亞硫酸鉀K2S2O5。一、紅葡萄酒釀造工藝（3）葡萄汁成分調(diào)整糖分調(diào)整：添加白砂糖或濃縮葡萄汁，使糖度達(dá)到20%；酸度調(diào)整：添加酒石酸和檸檬酸，調(diào)至酸度6.0g/L，pH3.3～3.5;顏色調(diào)整：用熱浸漬法，加快色素浸出。一、紅葡萄酒釀造工藝（4）主發(fā)酵紅葡萄酒的主發(fā)酵階段主要是酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵、浸提色素與芳香物質(zhì)的過程。發(fā)酵溫度：20～30℃發(fā)酵時(shí)間：6～7天發(fā)酵容器一、紅葡萄酒釀造工藝（5）后發(fā)酵1234殘?zhí)抢^續(xù)發(fā)酵陳釀作用澄清作用降酸作用后發(fā)酵階段的主要作用：酵時(shí)間：30天左右一、紅葡萄酒釀造工藝（6）儲(chǔ)藏與陳釀新酒經(jīng)過貯藏陳釀，逐漸成熟，口味變得柔協(xié)、舒順，達(dá)到最佳飲用質(zhì)量。貯酒容器：橡木桶、水泥池、金屬灌；換桶：使過量的揮發(fā)性物質(zhì)揮發(fā)逸出及添加硫酸溶液調(diào)節(jié)酒中二氧化硫含量；滿桶：避免箘膜及醋酸菌生長(zhǎng)，隨時(shí)使貯酒桶內(nèi)葡萄酒裝滿，不與空氣接觸；貯酒時(shí)間：紅葡萄原酒一般2～4年。一、紅葡萄酒釀造工藝（7）原酒的澄清目的：去除從原料中帶來的蛋白質(zhì)、樹膠、及部分單寧、色素等物質(zhì)。澄清方法：膠凈化：明膠、魚膠、蛋清、干酪素、皂土。機(jī)械凈化：過濾、離心。一、紅葡萄酒釀造工藝（7）原酒的澄清葡萄酒色澤影響因素：pH作用亞硫酸作用金屬離子作用氧化還原作用穩(wěn)定性處理方式：熱處理冷處理張?jiān)０倌甏缶平压そ尘襻u油生產(chǎn)工藝-固態(tài)低鹽

發(fā)酵工藝021.醬油的歷史醬油是由“醬”演變而來，起源于中國(guó)周朝。鮮肉大豆。唐朝傳入日本。2.生產(chǎn)方法低鹽固態(tài)發(fā)酵法上海調(diào)味品研究所在20世紀(jì)70年代研制。設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)易、原料利用率高、發(fā)酵周期短等優(yōu)點(diǎn)。目前普遍采用該法。高鹽稀態(tài)發(fā)酵法vs低鹽固態(tài)發(fā)酵法3.醬油釀造的原輔料基本原料為提供蛋白質(zhì)的大豆和(或)脫脂大豆，提供淀粉的小麥和(或)麩皮，以及食鹽和水。輔助原料主要有增色劑、助鮮劑、防腐劑等。4.種曲制備種曲即醬油發(fā)酵時(shí)所用的種子，它是生產(chǎn)所需要的菌種，如米曲霉、油曲霉、黑曲霉。種曲制備流程：菌種斜面試管培養(yǎng)三角瓶培養(yǎng)種曲(擴(kuò)大曲)醬油釀造中的主要微生物米曲霉（Aspergillusoryzae)最適溫度是32-35℃。最適宜pH為6.5～6.8。曲含水48%-50%。好氧微生物。米曲霉具有將強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解能力和淀粉糖化能力，能把原料中的蛋白質(zhì)和淀粉等水解成氨基酸和糖分。3.制曲工藝流程制曲是種曲在醬油原料上擴(kuò)大培養(yǎng)的過程。實(shí)質(zhì)就是創(chuàng)造曲霉菌適宜的生長(zhǎng)條件，促使曲霉充分發(fā)育繁殖，分泌醬油釀造需要的各種酶類，包括蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。3.制曲工藝流程制曲工藝控制環(huán)節(jié)①品溫（原料內(nèi)部溫度）控制在30～35℃之間；②原料混合及潤(rùn)水均勻，接種均勻、裝池疏松均勻，料層厚薄均勻；③要求原料蒸煮質(zhì)量好，達(dá)到蛋白質(zhì)適度變性和淀粉全部糊化；④熟料水分適當(dāng)，控制在48%～50%之間；⑤必須有足夠的風(fēng)量和風(fēng)壓，滿足米曲霉的好氧要求；⑥培養(yǎng)24h左右，曲呈淡黃綠色，此時(shí)應(yīng)及時(shí)出曲。4.發(fā)酵低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝：是控制醬醅中的食鹽含量在10％以下，這樣對(duì)蛋白酶等酶活力的抑制作用不大。4.發(fā)酵食鹽水的濃度：要求12~13波美度（°Bé）；發(fā)酵操作要點(diǎn)：制醅用鹽水的溫度：一般在50~55℃之間，醬醅開始發(fā)酵時(shí)溫度需降至42~44℃；制醅用鹽水要求底少面多；拌水量必須恰當(dāng)。5.提取及加熱、配制醅成熟后，經(jīng)過浸泡和過濾，將有效成分從醬醅中分離出來，從醬醅中淋出的頭油稱生醬油，還需經(jīng)過加熱及配制等工序才能成為各個(gè)等級(jí)的醬油成品。（1）浸出主要包括三個(gè)過程：浸取、洗滌、過濾。5.提取及加熱、配制（2）加熱目的是殺滅醬油中的微生物，防止生霉，延長(zhǎng)貯存時(shí)間；提升香氣，改善口感，增加色澤；澄清醬油。（3）配制加入添加劑，調(diào)制出不同品種規(guī)格醬油。通過配制可以使成品醬油的各項(xiàng)理化指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)?？梢苑€(wěn)定質(zhì)量、降低成本、節(jié)約原料、提高出品率。青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝03發(fā)展歷史1929年，英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明（Fleming）?？股赜晌⑸铮?xì)菌、真菌、放線菌）或高等動(dòng)植物，在生命活動(dòng)過程中產(chǎn)生的，在低濃度下，能選擇性地抑制其他生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)?？股厣a(chǎn)一般工藝流程菌種→孢子制備→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預(yù)處理→提取及精制→成品檢驗(yàn)包裝青霉素生產(chǎn)青霉素是人類發(fā)明的第一種抗生素，也是全球銷量最大的抗生素之一。1.菌種青霉菌是產(chǎn)生青霉素的重要菌種：產(chǎn)黃青霉、點(diǎn)青霉。生長(zhǎng)過程：分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒減少，小空孢大空孢自溶2.孢子制備孢子制備：將保藏的處于休眠狀態(tài)的孢子，在嚴(yán)格的無菌條件下，將其接種到經(jīng)滅菌過的固體斜面培養(yǎng)基上，在25℃下培養(yǎng)6-7日。擴(kuò)大培養(yǎng)：必要時(shí)可進(jìn)一步用扁瓶在固體培養(yǎng)基上（例如大米、小米、玉米、麩皮等）擴(kuò)大培養(yǎng)。種子制備：是指孢子接入種子罐后，在罐中繁殖成大量菌絲的過程。目的：是使孢子發(fā)芽、繁殖和獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐中。3.種子制備4.發(fā)酵青霉素發(fā)酵時(shí)，青霉素生產(chǎn)菌在合適的培養(yǎng)基、pH、溫度和同氣攪拌等發(fā)酵條件下進(jìn)行聲場(chǎng)并合成青霉素。制備青霉素一般是采用無菌操作法及冷凍干燥技術(shù)。4.發(fā)酵培養(yǎng)基①碳源淀粉經(jīng)酶水解的葡萄糖糖化液進(jìn)行流加。②氮源玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩子粉，并補(bǔ)加無機(jī)氮源。③前體苯乙酸或苯乙酰胺?？刹捎枚啻渭尤敕绞健＂軣o機(jī)鹽硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。4.發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)控制①加糖控制②補(bǔ)氮及加前體③pH控制④溫度控制⑤通氣和攪拌⑥泡沫和消泡5.發(fā)酵液預(yù)處理連續(xù)轉(zhuǎn)鼓真空過濾機(jī)目的：方法：分離菌絲、去除雜質(zhì)?？杉由倭啃跄齽┏恋淼鞍?。板框過濾除菌絲及部分蛋白。發(fā)酵液及濾液冷卻至10℃低溫保存。6.提取及精煉提取結(jié)晶脫色干燥基因工程菌的發(fā)酵04屠呦呦青蒿素，有效降低瘧疾患者的死亡率2015年諾貝爾生物學(xué)或藥學(xué)獎(jiǎng)“三無科學(xué)家”學(xué)術(shù)深厚、品德高尚1.何謂基因工程？指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，根據(jù)人們的意愿，主要是在體外進(jìn)行基因切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特性的生物類型，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代?；蚬こ痰暮诵募夹g(shù)是DNA重組技術(shù)。2.基因工程菌的獲得確定目的產(chǎn)物；找出該產(chǎn)物的細(xì)胞；將細(xì)胞破碎后提純出全部mRNA，采用反轉(zhuǎn)錄技術(shù)合成cDNA；利用基因擴(kuò)增技術(shù)(PCR)，克隆所需的目的基因?qū)⒛康幕蜻B接到設(shè)計(jì)好的質(zhì)粒載體，形成重組DNA分子；將重組后的DNA分子引入到受體細(xì)胞內(nèi)，然后選擇合適的培養(yǎng)條件使細(xì)胞繁殖；根據(jù)選擇性標(biāo)記，從菌落中篩選出目的基因的重組(工程)菌。（1）獲得方法2.基因工程菌的獲得發(fā)酵產(chǎn)品是高濃度、高轉(zhuǎn)化率和高產(chǎn)率，同時(shí)是分泌型菌株。菌株能利用常用碳源，并可進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。菌株不是致病株，也不產(chǎn)內(nèi)毒素。代謝控制容易進(jìn)行。能進(jìn)行適當(dāng)DNA重組，并且穩(wěn)定，重組DNA不易脫落。（2）工程菌應(yīng)具備條件（1）培養(yǎng)裝置不僅要防止外部微生物侵入罐內(nèi)，還必須采用不是培養(yǎng)物外漏的培養(yǎng)裝置。3.基因工程菌的培養(yǎng)（2）基因重組菌外漏的防范排氣：加藥劑槽；加排氣鼓泡器。機(jī)械密封：雙機(jī)械密封的上攪拌方式。取樣：用取樣工具進(jìn)行取樣。培養(yǎng)后的滅菌：排放污水的處理，安裝排水管與廢液滅菌貯槽相連。接種：將種子瓶與培養(yǎng)罐以管相連，用無菌空氣加壓壓入的方法。排液：將排液口與下段工序相連接并進(jìn)行滅菌。4.基因工程產(chǎn)品的提取與精制提取方法數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗(yàn)；產(chǎn)品位于細(xì)胞內(nèi)，提取前先將細(xì)胞粉碎；一般要求在密閉環(huán)境下操作，防治菌體擴(kuò)散。5.基因工程藥物發(fā)酵的應(yīng)用領(lǐng)域已開始由實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)生產(chǎn)、實(shí)用。菌種改良，產(chǎn)生珍稀藥物，攻克疑難雜癥。保證藥物來源，降低成本。如紅細(xì)胞生成素、胰島素、干優(yōu)素、乙肝疫苗、生長(zhǎng)激素和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子等。6.基因工程藥物生產(chǎn)過程（1）基因工程藥物生產(chǎn)主要程序獲得目的基因→組建重組質(zhì)粒→構(gòu)件基因工程菌→培養(yǎng)工程菌→產(chǎn)品分離純化→除菌過濾→半成品鑒定→成品鑒定→包裝。（2）基因工程菌的發(fā)酵工藝通過搖瓶了解工程菌生長(zhǎng)的基礎(chǔ)條件，包括溫度、pH、培養(yǎng)基各組分以及碳氮比；分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對(duì)受體細(xì)胞的影響通過發(fā)酵罐的放大試驗(yàn)，確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。7.基因工程藥物生產(chǎn)實(shí)例基因工程α-2b干擾素的制備工藝（1）工藝流程菌種→種子培養(yǎng)→發(fā)酵→粗提→精提→半成品制備→半成品鑒定→分裝→凍干→產(chǎn)品鑒定→產(chǎn)品包裝。7.基因工程藥物生產(chǎn)實(shí)例基因工程α-2b干擾素的制備工藝（2）工藝要點(diǎn)①菌種基因工程菌為E.coliDH5a（或SW-IFNα-2b），質(zhì)粒用PL啟動(dòng)因子，含氨芐（bian）青霉素抗性基因。②種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉5g/L。用4個(gè)1000mL三角瓶，各裝250mL培養(yǎng)液，滅菌后冷卻至室溫。接入基因工程菌，30℃搖床培養(yǎng)10h，發(fā)酵種子。7.基因工程藥物生產(chǎn)實(shí)例基因工程α-2b干擾素的制備工藝（2）工藝要點(diǎn)③發(fā)酵發(fā)酵在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行。發(fā)酵液的裝量為15L。發(fā)酵培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基在發(fā)酵罐內(nèi)滅菌后，冷卻到30℃，接入培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液約1L，開始發(fā)酵。④產(chǎn)品的提純與純化離心去上清液，濕菌超聲破碎，離心，上清超濾濃縮，分離。經(jīng)SDS檢查，再經(jīng)DE-52柱純化。淀粉酶生產(chǎn)05中國(guó)酶工程創(chuàng)始人程玉華敢于創(chuàng)新勇于實(shí)踐不斷探索什么是淀粉酶淀粉酶屬于水解酶類，是催化淀粉（包括糖原、糊精）中糖苷鍵水解的一類酶類的統(tǒng)稱。淀粉酶是研究較多、生產(chǎn)最早、產(chǎn)量最大和應(yīng)用最廣泛的一類酶。按照水解淀粉的方式不同：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脫支酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶等。α-淀粉酶α-淀粉酶能水解淀粉產(chǎn)生糊精、麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的酶制劑之一。目前α-淀粉酶已廣泛應(yīng)用于變性淀粉及淀粉糖、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、酒精工業(yè)、發(fā)酵以及紡織等許多行業(yè)。1.菌種工業(yè)上生產(chǎn)α-淀粉酶的菌種主要有細(xì)菌和霉菌兩大類。典型為枯草桿菌和米曲霉。米曲霉常用固態(tài)發(fā)酵法培養(yǎng)，其產(chǎn)品主要用作消化劑，產(chǎn)量較?。豢莶輻U菌常用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)，能大規(guī)模地生產(chǎn)α-淀粉酶。2.種子擴(kuò)大培養(yǎng)將保存在淀粉瓊脂斜面上的孢子用無菌水洗下，接種到錐形瓶中，在35℃靜置2-4天，待長(zhǎng)出大量孢子后做為接種用的種子。（1）孢子制備α-淀粉酶生產(chǎn)一般采用二級(jí)發(fā)酵。流程如下：孢子→錐形瓶→種子罐→發(fā)酵罐。2.種子擴(kuò)大培養(yǎng)（2）種子制備種子培養(yǎng)配方：黃豆餅粉40g/L，玉米粉30g/L，磷酸氫二鈉8g/L，硫酸銨14g/L，硫酸銨4g/L，氯化銨1.5g/L，121℃滅菌30min。將保藏的菌種接種到馬鈴薯瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)72h。然后接入到種子罐，37℃攪拌，通風(fēng)培養(yǎng)12-14小時(shí)。此時(shí)菌種進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，再接種到發(fā)酵罐。3.發(fā)酵3.發(fā)酵（1）米曲霉固態(tài)發(fā)酵法將試管斜面于32～34℃培養(yǎng)70～72h，接種到三角瓶，每24h扣瓶一次，待菌體大量生長(zhǎng)孢子轉(zhuǎn)出黃綠色時(shí)，即可作為種子用于制備種曲。培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后放入種曲箱房，打碎團(tuán)塊冷卻到30℃左右接入0.5～1％的三角瓶種子，拌勻后放入曲盒，料層厚度1cm左右為宜。曲房?jī)?nèi)保持30℃左右進(jìn)行培養(yǎng)。蓋布應(yīng)每隔8～12h用水浸濕，以保持一定濕度，每24h扣盤一次，經(jīng)3d后，種曲成熟，麥麩上布滿黃綠色孢子。3.發(fā)酵厚層通風(fēng)固體發(fā)酵，蒸煮1h后培養(yǎng)基冷卻到30℃接入0.5％的種曲，拌勻后入池發(fā)酵。前期品溫控制在30℃左右，每隔2h通風(fēng)20min，當(dāng)池內(nèi)品溫上升至36℃以上時(shí)則需要連續(xù)通風(fēng)，使溫度控制在34～36℃。當(dāng)池內(nèi)溫度開始下降后2～3h則通冷風(fēng)使品溫下降到20℃左右出池。整個(gè)發(fā)酵過程約需要28h。（1）米曲霉固態(tài)發(fā)酵法3.發(fā)酵（2）枯草桿菌液體深層發(fā)酵法3.發(fā)酵發(fā)酵控制溫度37℃，罐壓0