第26章重組藥物

第26章

重組藥物本章目錄第一節(jié)重組藥物概述第二節(jié)重組藥物的通用制造方法與技術(shù)第三節(jié)重組藥物的分離純化技術(shù)關(guān)鍵第四節(jié)重組藥物的質(zhì)量控制第五節(jié)典型重組藥物制造技術(shù)及工藝

20世紀(jì)70年代建立的DNA重組技術(shù)帶來了生物技術(shù)新的變革，促進了以基因工程技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)的誕生和發(fā)展，被認(rèn)為是20世紀(jì)人類的一項最偉大的貢獻。DNA重組技術(shù)，亦稱基因重組技術(shù)，是指將DNA片段（如基因）按人們的設(shè)計方案定向地與載體相連，并轉(zhuǎn)入特定的受體細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌（或細(xì)胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。應(yīng)用DNA重組技術(shù)表達(dá)和生產(chǎn)的多肽或蛋白質(zhì)類藥物，稱為重組藥物。第一節(jié)

重組藥物概述應(yīng)用DNA重組技術(shù)可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽，提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理生化及結(jié)構(gòu)等進行深入的研究和開發(fā)應(yīng)用，還可以對已有的藥物進行改造，克服其不足，創(chuàng)造自然界不存在的全新物質(zhì)。重組藥物制造的通用方法流程為：①獲得目的基因；②將目的基因和載體連接，構(gòu)建DNA重組體；③將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌；④工程菌的發(fā)酵；⑤外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化；⑥產(chǎn)物的檢驗和制劑制備等。第二節(jié)重組藥物的通用制造方法與技術(shù)在操作過程中需注意：1、操作條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；2、選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來，達(dá)到較高的純化倍數(shù)；3、收率要高；4、兩個技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對物料加以處理調(diào)整，這樣可以減少工藝步驟；5、整個分離純化過程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。

重組藥物分離純化的一般流程為：固液分離、細(xì)胞破碎、提取、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工等。第三節(jié)

重組藥物的分離純化技術(shù)關(guān)鍵構(gòu)建好的基因工程菌在適當(dāng)條件下培養(yǎng)發(fā)酵，表達(dá)重組藥物后，還需選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x純化方法將產(chǎn)物提純，制成特定的制劑，才能被應(yīng)用于臨床。

而且基因工程菌培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)物中含有大量的細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基、無機鹽等，而目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低，同時重組藥物一般都需注射給藥，對其質(zhì)量、純度要求高。為獲得合格的目的產(chǎn)物，必須建立與上述特點相適應(yīng)的分離純化工藝。分離純化重組藥物須重點考慮下列幾個技術(shù)因素：1.產(chǎn)物的表達(dá)形式2.根據(jù)蛋白產(chǎn)物性質(zhì)選用適宜的層析類型3.分離單元之間的銜接4．分離純化工藝的要求1.產(chǎn)物的表達(dá)形式根據(jù)外源基因表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的定位，可將表達(dá)方式分為分泌型表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)。外源蛋白的分泌表達(dá)是通過將外源基因融合到編碼信號肽序列的下游來實現(xiàn)的。將外源基因接在信號肽之后，表達(dá)產(chǎn)物在信號肽的引導(dǎo)下跨膜分泌出胞外，同時在宿主細(xì)胞膜上存在特異的信號肽酶，它識別并切掉信號肽，從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液的體積很大，但濃度較低，因此必須在純化前富集或濃縮，可以用吸附、沉淀或超濾的方法來進行富集或濃。如果表達(dá)產(chǎn)物前沒有信號肽序列，它可以可溶形式或不可溶形式（包涵體）存在于細(xì)胞中。對于胞內(nèi)產(chǎn)物，首先要通過離心或過濾的方式收集細(xì)胞，并采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄆ票?。在工業(yè)生產(chǎn)中常用大腸桿菌作為宿主菌來生產(chǎn)目的蛋白，在大腸桿菌中當(dāng)外源蛋白的表達(dá)量達(dá)到20%以上時，它們一般就會以包涵體（inclusionbody）的形式存在。如果蛋白質(zhì)以胞內(nèi)可溶表達(dá)形式存在，則收集菌體后破壁，離心取上清液，然后用親和層析或離子交換法進行純化。在純化過程中還常采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo措施，如低溫、加入保護劑、盡量縮短純化工藝及時間等措施來防止產(chǎn)物的降解和破壞。外源蛋白的復(fù)性是利用包涵體獲得外源蛋白最關(guān)鍵也是最復(fù)雜的一步。重組蛋白的復(fù)性操作主要有兩種方法：一種是將溶液稀釋，導(dǎo)致變性劑的濃度降低，促進蛋白質(zhì)復(fù)性。

另外表達(dá)產(chǎn)物還可存在于大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中，這是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)之間的一種形式，它可以避開細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質(zhì)，在一定程度上有利于分離純化。大腸桿菌經(jīng)低濃度溶菌酶處理后，可采用滲透沖擊的方法來獲得周質(zhì)蛋白。缺點是滲透沖擊的方法破壁不完全，產(chǎn)物的收率較低。2.根據(jù)蛋白產(chǎn)物性質(zhì)選用適宜的層析類型基因工程產(chǎn)物常需采用層析來進行精制以達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)。在選擇層析類型和條件時要綜合考慮蛋白質(zhì)的性質(zhì)。如蛋白質(zhì)的等電點和表面電荷的分布及目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。親和層析是一種高效的分離純化手段，不同的蛋白質(zhì)可以選用不同的特異性親和配基，如酶和底物、抗原與抗體、糖鏈和凝集素等。由于親和分離的選擇性強，因此在產(chǎn)物純化中具有較大的潛力；疏水作用層析和反相作用層析是利用蛋白質(zhì)疏水性的差異來分離純化蛋白質(zhì)。一般是目的蛋白與配基結(jié)合而雜蛋白不結(jié)合，目的蛋白吸附后再利用快速變換洗脫液和加入競爭劑的方法進行洗脫。

二者的不同在于疏水作用層析通常在水溶液中進行，蛋白在分離過程中仍保持其天然構(gòu)象，而反相作用層析是在有機相中進行，蛋白經(jīng)過反相流動相與固定相的作用有時會發(fā)生部分變性；凝膠排阻層析根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量以及蛋白質(zhì)分子的動力學(xué)體積的大小來進行分離的，它可應(yīng)用于蛋白質(zhì)脫鹽和蛋白質(zhì)分子的分級分離。3.分離單元之間的銜接考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，一般早期盡可能采用高效的分離手段，如通常先用非特異、低分辨的操作單元方法，以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要的雜質(zhì)；然后采用高分辨率的操作方法，而將凝膠排阻色譜這類分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元放在最后，以提高分離效果。當(dāng)幾種方法連用時，最好以不同的分離機制為基礎(chǔ)，而且經(jīng)前一種方法處理樣品應(yīng)能適合于作為后一種方法的料液。如果經(jīng)鹽析后得到的產(chǎn)品，不適宜于離子交換層析，但可直接應(yīng)用于疏水層析。離子交換、疏水及親和色譜通?？善鸬降鞍踪|(zhì)濃縮的效應(yīng)，而凝膠過濾色譜常常使樣品稀釋，在離子交換色譜之后進行疏水層析色譜就很合適，不必經(jīng)過緩沖溶液的更換，因為多數(shù)蛋白質(zhì)在高離子強度下與疏水介質(zhì)結(jié)合較強。親和層析選擇性最強，但不能放在第一步，一方面因為雜質(zhì)多，易受污染，降低使用壽命；另一方面，體積較大，需要大量的介質(zhì)，而親和層析介質(zhì)一般較貴。因此親和層析多放在第二步以后。有時為了防止介質(zhì)中毒，在其前面加一保護柱，通常為不帶配基的介質(zhì)。經(jīng)過親和層析后，還可能有脫落的配基存在，而且目的蛋白質(zhì)在分離和純化過程中會聚合成二聚體或更高的聚合物，特別是當(dāng)濃度較高，或含有降解產(chǎn)物時更易形成聚合體，因此最后需經(jīng)過進一步純化操作，常使用凝膠過濾色譜，也可用高效液相色譜法，但費用較高。4．分離純化工藝的要求在重組藥物分離純化過程中，通常需要綜合使用多種分離純化技術(shù)。另外，作為藥品，其生產(chǎn)必須保證安全、無菌、無熱源、無污染。1、分離純化工藝要求有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，減小原料及設(shè)備對產(chǎn)品的影響。2、工藝的步驟盡可能少，時間要盡可能短，以減少生物活性物質(zhì)的破壞失活。3、組成工藝的各技術(shù)、步驟之間及設(shè)備間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，且高效，收率高，易操作，對設(shè)備條件要求低，能耗低，并盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟或干擾產(chǎn)品質(zhì)量。第四節(jié)

重組藥物的質(zhì)量控制重組藥物與其它傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的藥品有許多不同之處，它利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，并具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)。它的生產(chǎn)涉及到生物材料和生物學(xué)過程，如：發(fā)酵、細(xì)胞培養(yǎng)、分離純化目的產(chǎn)物，這些過程有其固有的易變性。同時由于重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往在極微量下就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)，任何藥物性質(zhì)或劑量上的偏差，都可能貽誤病情甚至造成嚴(yán)重危害。原材料質(zhì)量控制往往采用細(xì)胞學(xué)、表型鑒定、抗生素抗性檢測、限制性內(nèi)切酶圖譜測定、序列分析與穩(wěn)定性監(jiān)控等方法。1.需明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)志物等；一、原材料質(zhì)量控制

2.應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性等；

3.還需闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體內(nèi)及在其中的拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；4.提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中，啟動與控制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。在培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制上，要求種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)過程中工程菌不應(yīng)出現(xiàn)突變或質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。生產(chǎn)重組藥物應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫。原始種子批需確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計使用期，保存與復(fù)蘇時宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。對菌種最高允許的傳代次數(shù)、維持培養(yǎng)時間等也必須做詳細(xì)說明。二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制在純化工藝過程的質(zhì)量控制上，要考慮到盡量去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白、糖及其它雜質(zhì)，并避免在純化過程帶入的有害物質(zhì)。如用柱層析技術(shù)應(yīng)提供所用填料的質(zhì)量認(rèn)證證明，并證實從柱上不會掉下有害物質(zhì)。上樣前應(yīng)清洗除去熱源等。純化工藝的每一步均應(yīng)測定純度，計算提純倍數(shù)、收率等。純化工藝過程中應(yīng)盡量不加入對人體有害的物質(zhì)，若不得不加時，應(yīng)設(shè)法除凈，并在最終產(chǎn)品中檢測殘余量，應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有害劑量，同時還要考慮到多次使用的積蓄作用。三、純化工藝過程的質(zhì)量控制

目前有許多方法可用于對重組技術(shù)所獲得蛋白質(zhì)藥物進行全面鑒定，如用各種電泳技術(shù)分析、高效液相色譜分析、肽圖分析、氨基酸成分分析、部分氨基酸序列分析及免疫學(xué)分析的方法等。四、對最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制主要包括產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。

對其純度測定通常采用的方法有還原性及非還原性SDS、等電聚焦、各種HPLC、毛細(xì)管電泳等，需有兩種以上不同機制的分析方法相互佐證，以便對目的蛋白質(zhì)的質(zhì)量進行綜合評價；在其雜質(zhì)控制上要檢測內(nèi)毒素、熱原、宿主細(xì)胞蛋白、殘余DNA等。對其生物活性需采用國際或國家參考品，或經(jīng)過國家鑒定機構(gòu)認(rèn)可的參比品，以體內(nèi)或細(xì)胞法測定制品的生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位；在安全性上需按照“中國生物制品規(guī)程”進行無菌試驗、熱原試驗、毒性和安全試驗。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，可能同時存在多種降解途徑，因此須在實際條件下長期觀測穩(wěn)定性，對產(chǎn)品一致性、純度、分子特征和生物效價等多方面的變化情況加以綜合評價，確定產(chǎn)品的貯藏條件和使用期限等。第五節(jié)

典型重組藥物制造技術(shù)及工藝下面介紹幾種臨床上極為重要的重組藥物如干擾素、生長素、胰島素等的生產(chǎn)技術(shù)及工藝。5.1重組人干擾素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.2重組人胰島素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.3重組人生長素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.4重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.1重組人干擾素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.1.1重組人干擾素概述干擾素（interferon，IFN）是機體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，是機體受到病毒感染時，免疫細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。根據(jù)干擾素來源及其基因序列和氨基酸組成不同，可將干擾素分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型干擾素的表達(dá)細(xì)胞來源類似，包括干擾素-α、β、ω、τ和λ。用病毒等刺激外周血漿樣樹突細(xì)胞（pDCs）可以產(chǎn)生干擾素-α、β、ω的13種亞型，3種干擾素-τ亞型和干擾素-λ，但是沒有Ⅱ型干擾素-γ。

干擾素的生物學(xué)活性相當(dāng)廣泛，主要包括廣譜抗病毒活性、直接抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性。1.干擾素抗病毒作用的特點是：①不能殺死病毒，只能抑制；②對病毒沒有直接的作用，通過細(xì)胞核內(nèi)的基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)因子發(fā)揮作用，因此不同細(xì)胞對干擾素的敏感不同；③病毒大量復(fù)制時引發(fā)細(xì)胞炎癥應(yīng)答，此時易產(chǎn)生作用；④當(dāng)病毒DNA已整合到宿主細(xì)胞的染色質(zhì)中時，干擾素不能發(fā)揮其抗病毒活性。2.干擾素抗腫瘤作用：①直接抑制腫瘤細(xì)胞；②調(diào)節(jié)宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)；③改變宿主與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系。3．干擾素的免疫調(diào)節(jié)活性①對免疫監(jiān)視系統(tǒng)②對免疫防衛(wèi)系統(tǒng)③對免疫自穩(wěn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)干擾素的臨床應(yīng)用廣泛。干擾素在機體的免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用，在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂和免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性。（1）抗病毒干擾素-α/β能誘導(dǎo)機體對多種肝炎病毒、鼻病毒、人乳頭瘤病毒、艾滋病病毒和多種RNA病毒產(chǎn)生抵抗力。（2）治療腫瘤干擾素是一種較理想的腫瘤抑制蛋白，它能調(diào)節(jié)正常的和惡性化的細(xì)胞生長和分化。 （3）其它應(yīng)用有報道用干擾素治療精子缺乏癥、多發(fā)性硬化癥、黃斑變性癥等。5.1.2重組人干擾素生產(chǎn)技術(shù)和工藝重組人干擾素的生產(chǎn)主要包括工程菌的構(gòu)建、發(fā)酵、發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化及制劑加工等單元操作技術(shù)和工藝。一、工程菌的構(gòu)建（1）干擾素基因的克?。?）干擾素表達(dá)載體的構(gòu)建（3）基因工程菌應(yīng)具備的特性：①革蘭陰性，桿狀，長度3～5μm。30℃培養(yǎng)24h，其菌落為2.5～3.0mm，灰綠色半透明狀，具有粘稠性。②不能將明膠、淀粉液化為可溶性單糖，不能利用進行厭氧呼吸，能夠合成熒光色素。菌株為蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型，可以利用L-纈氨酸作為碳源。③遺傳特性DNA中G+C含量為63%。細(xì)胞中攜帶pVG3質(zhì)粒，具有硫酸鏈霉素、鹽酸四環(huán)素和氨芐青霉素的抗性。④放射性免疫學(xué)效價不能低于2.0×109IU/L。（4）菌種庫的建立及保存（5）工作菌種庫的建立及保存二、重組人干擾素-α2b的發(fā)酵工藝及過程控制生產(chǎn)菌種接種菌種活化種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵液降溫菌體搜集離心菌體冷凍保存蒸汽滅菌蒸汽滅菌配制培養(yǎng)基原料蒸汽滅菌1.發(fā)酵工藝過程2.發(fā)酵過程控制(1)假單胞桿菌的生長和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài)。(2)一般的，種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分宜豐富些，尤其是氮源的含量應(yīng)較高（即C/N低）。(3)發(fā)酵要求培養(yǎng)液中有足夠的溶解氧，為了提高發(fā)酵罐的供養(yǎng)能力，往往需要增大攪拌轉(zhuǎn)速，增加空氣流量，或通入純氧。(4)假單胞桿菌你的生長最適溫度與產(chǎn)物形成的最適溫度是不同的。穩(wěn)定而適中的溫度既能保證菌體細(xì)胞膜的完整和細(xì)胞中酶的催化活性，又有利于提高干擾素的產(chǎn)量。(5)pH值發(fā)酵過程中，pH的變化由工程菌的代謝、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件所決定。(6)隨著菌體繁殖，使整個發(fā)酵過程形成過多和穩(wěn)定持久的泡沫。可采用機械攪拌和加入少量表面活性劑來消除泡沫。1.重組人干擾素-α2b的分離工藝過程：a.菌體裂解b.沉淀c.離心d.鹽析e.離心與儲存2.重組人干擾素-α2b純化工藝過程：

a.配制純化緩沖液b.溶解粗干擾素c.沉淀除雜質(zhì)d.離心e.疏水色譜f.沉淀g.超濾h.透析i.陰離子交換色譜j.濃縮和透析k.陰離子交換色譜l.濃縮m.凝膠過濾色譜n.無菌過濾分裝o.質(zhì)量控制3.重組人干擾素-α2b分離工藝控制：a.使用保護劑b.使用絮凝劑c.使用凝聚劑4.重組人干擾素-α2b的純化工藝控制：a.等電點沉淀b.膜分離c.疏水色譜d.離子交換色譜e.凝膠過濾色譜f.無菌灌裝三、分離純化工藝及過程控制干擾素的分離與純化分為兩個階段，初級分離階段和純化精制階段。整個分離純化過程的主要問題是保證干擾素的活性。蛋白質(zhì)失活的機理概括起來有兩點。①一級結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)的變化，造成失活。②如果一級結(jié)構(gòu)沒被破壞，三級和四級結(jié)構(gòu)的變化也可能導(dǎo)致失活。蛋白質(zhì)活性損失的原因有很多，一般有以下的因素：溫度、流體狀態(tài)、摩擦、剪切力、吸附、截流、pH和介質(zhì)條件、溶解中氣體、微生物、活性抑制劑等。四、重組人干擾素的制劑類型干擾素的劑型也在早期的注射劑的基礎(chǔ)上增加了鼻腔內(nèi)給藥系統(tǒng)、軟膏劑、栓劑、口含制劑、外用凝膠制劑、長效制劑及緩釋制劑等。1.干擾素注射劑：干擾素的主要劑型為注射劑，主要用于病毒感染性疾病和腫瘤的治療。2.長效干擾素制劑：將聚乙二醇（PEG）分子結(jié)合到干擾素上，使其半衰期延長，顯著增加了藥物在體內(nèi)保持活性狀態(tài)的時間，因而患者每周只需要注射一次即可。3.鼻腔內(nèi)給藥系統(tǒng)干擾素-α鼻腔內(nèi)給藥能抑制由鼻病毒引起的實驗性感染，因此，可用于鼻病毒引起的呼吸系統(tǒng)感染。4.其它上市制劑：①栓劑②外用凝膠制劑③眼用制劑5.研發(fā)中的干擾素制劑①緩釋制劑②靶向制劑③口含制劑5.2重組人胰島素生產(chǎn)技術(shù)及工藝.5.2.1重組人胰島素概述胰島素（insulin）是多肽激素，由胰臟β細(xì)胞合成。成熟的胰島素由AB雙鏈組成，A鏈具有21個氨基酸殘基，B鏈具有30個氨基酸殘基，3對二硫鍵，2對鏈間二硫鍵，一對鏈內(nèi)二硫鍵，胰島素的生理功能廣泛，能促進糖原合成和糖酵解，產(chǎn)生ATP，降低血糖含量，保持能量供應(yīng)。缺乏胰島素時，導(dǎo)致人消瘦，高血糖和丙酮酸中毒，Ⅰ型糖尿?。╠iabetes）就是缺乏胰島素引起的。胰島素主要應(yīng)用于治療糖尿病，但長期使用會引起腎和眼病。一系列的研究表明，重組人胰島素在結(jié)構(gòu)與功能上與天然胰島素均相同。在獲得臨床許可之前，人的臨床追蹤也發(fā)現(xiàn)重組胰島素在控制血糖水平方面與以前的胰島素產(chǎn)品一樣有效。5.2.2重組人胰島素生產(chǎn)技術(shù)及工藝重組人胰島素的生產(chǎn)主要采用兩種宿主表達(dá)系統(tǒng)，即大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)。一、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組人胰島素大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)胰島素有兩個優(yōu)點，一是表達(dá)量高，一般表達(dá)產(chǎn)物可以達(dá)到大腸桿菌總蛋白量的20%-30%；二是表達(dá)產(chǎn)物為不溶解的包含體，所以經(jīng)過水洗后表達(dá)產(chǎn)物的純度就可以達(dá)90%左右，因而易于下游純化。其缺點是表達(dá)出的胰島素尚沒有生物活性，需要變性和復(fù)性過程。二、酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組人胰島素 用酵母表達(dá)人胰島素的工藝優(yōu)點是，表達(dá)產(chǎn)物二硫鍵的結(jié)構(gòu)與位置正確，不需要復(fù)性加工處理。其缺點是表達(dá)量低，發(fā)酵時間長。三、重組人胰島素的質(zhì)量控制測定產(chǎn)品的生物活性和含量，控制產(chǎn)品中雜質(zhì)或潛在有害物質(zhì)，保證產(chǎn)品的安全性和有效性，胰島素在臨床上長期重復(fù)使用，且劑量為毫克級，故必須考慮在生產(chǎn)過程中未除盡異種蛋白質(zhì)和自身降解產(chǎn)物潛在的危害性，鑒于胰島素產(chǎn)品上述特點，應(yīng)特別關(guān)注其有關(guān)雜質(zhì)。1.鑒別可用反相HPLC方法分析胰島素供試品和對照品，二者保留時間一致（相對保留時間為±2%）。2.效價測定現(xiàn)采用國際通用方法RP-HPLC測定效價，此法具有高專屬性，其結(jié)果與生物活性測定法一致。3.人胰島素原當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物為胰島素原融合蛋白，則需檢查原料中人胰島素原，常采用非放射性標(biāo)記方法，用生物素單抗和親和素酶標(biāo)記物方法，控制人胰島素原不得超過0.001%。常規(guī)胰島素注射液應(yīng)增加高分子蛋白檢查，其含量不超過相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。5.3重組人生長素生產(chǎn)技術(shù)及工藝.5.3.1重組人生長素概述生長素（growthhormone,GH,或somatotropin/Somatotrophin）是動物腦垂體前葉外側(cè)的特異分泌細(xì)胞分泌的一種促進生長的蛋白質(zhì)激素。生長激素具有種屬特異性，人生長激素（humangrowthhormone,hGH）為一鏈狀多肽的球形蛋白質(zhì)。目前重組人生長激素已經(jīng)在許多國家廣泛使用，適應(yīng)癥主要有：①治療侏儒癥及兒童生長素缺乏癥，在骨骼未閉合之前使用生長激素，可以刺激骨骼端軟骨細(xì)胞分化，增殖，刺激軟骨基質(zhì)生長，從而使身體長高；②調(diào)節(jié)心腎功能，治療因慢性腎功能不全導(dǎo)致的生長遲緩；③治療成人生長素缺乏癥；④有助于術(shù)后的傷口愈合，臨床上用于治療燒傷，潰瘍及大手術(shù)后的傷口的治療；⑤用于延緩衰老，改善運動能力，可提高機體的免疫力。5.3.2重組人生長素生產(chǎn)技術(shù)及工藝第一代重組人生長激素是采用包含體技術(shù)生產(chǎn)的，含有甲硫氨酸，由192個氨基酸殘基組成。1.重組人生長激素生產(chǎn)工藝流程與傳統(tǒng)的包含體技術(shù)相同，分泌型表達(dá)技術(shù)使生長素以天然構(gòu)象直接分泌于菌體之外的培養(yǎng)液中，避免了重折疊，收率高，受菌體蛋白污染少，純度高，更安全。2.基因工程大腸桿菌發(fā)酵工藝種子培養(yǎng)過夜，然后進行發(fā)酵，發(fā)酵時間一般為16-18h,培養(yǎng)溫度為37℃，期間發(fā)酵液的pH值維持在7.0-7.5，溶解氧不能低于20%。另外在培養(yǎng)過程中需要添加葡萄糖及微量元素。3.重組人生長激素分離工藝 4.重組人生長激素純化工藝5.重組人生長激素制劑質(zhì)量控制重組人生長激素凍干制劑，含重組人生長激素應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%-110.0%。大腸桿菌表達(dá)重組人生長激素生產(chǎn)的工藝流程5.4重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)技術(shù)及工藝5.4.1促紅細(xì)胞生成素概述1.促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO），又稱紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞生成刺激因子（erythropoietinstimulatingfactor，ESF），是調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞，對紅細(xì)胞生成有特異性刺激作用的細(xì)胞因子。促紅細(xì)胞生成素是一種糖蛋白，在胎兒體內(nèi)由腎臟及肝臟產(chǎn)生，而在成人體內(nèi)主要由腎臟產(chǎn)生，占90%。腎功能受到損害，如慢性腎衰竭的患者，促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生受阻，可導(dǎo)致貧血。2、促紅細(xì)胞生成素的種類(1)天然促紅細(xì)胞生成素：天然促紅細(xì)胞生成素是以人或動物的尿、血等為材料，經(jīng)生化技術(shù)分離純化制備。(2)重組人促紅細(xì)胞生成素：重組人促紅細(xì)胞生成素是以基因工程技術(shù)生產(chǎn)的人促紅細(xì)胞生成素。3、促促紅細(xì)胞生成素的臨床應(yīng)用重組促紅細(xì)胞生成素是目前臨床上治療慢性腎衰性貧血療效最顯著的生物技術(shù)藥物。

5.4.2重組人促紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)技術(shù)及工藝（一）重組人促紅細(xì)胞生成素表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建：1、重組人促紅細(xì)胞生成素表達(dá)載體的構(gòu)建有兩種方式獲得編碼人促紅細(xì)胞生成素基因。一種是提取胎肝染色體DNA，然后以特異性寡核苷酸為引物，經(jīng)PCR擴增出人促紅細(xì)胞生成素的基因片段，體外拼接，然后與克隆載體連接?；蚴呛Y選