化妝品原料修護(hù)功效評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法（征求意見稿） 編制說(shuō)明

1T/LNPCXXX-2024化妝品原料修護(hù)功效評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了基于體外人皮膚模型的化妝品原料的修護(hù)功效試驗(yàn)方法。本文件適用于具有生物學(xué)修護(hù)作用的化妝品原料修護(hù)功效試驗(yàn)。本文件可作為化妝品原料修護(hù)功效試驗(yàn)方法之一，對(duì)化妝品原料修護(hù)功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理受損后的皮膚屏障不但不能防止外界的不良物質(zhì)和病原菌的入侵，還容易發(fā)生皮膚干燥過(guò)敏等反應(yīng)。皮膚屏障的破壞涉及角質(zhì)層和真皮層。細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。它參與到很多生理和病理的活動(dòng)中。在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，劃痕邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕/傷口”愈合。本文件通過(guò)對(duì)表皮細(xì)胞劃痕后加入化妝品原料，檢測(cè)加入化妝品原料后，通過(guò)觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的愈合率進(jìn)而反映化妝品原料是否對(duì)皮膚有修復(fù)功效。5儀器及設(shè)備5.1生物安全柜。5.2倒置顯微鏡。5.3CO2培養(yǎng)箱：37℃,95%相對(duì)濕度、5%CO2/空氣。5.4分析天平：精度0.1mg。5.5微量移液器：5000μL、1000μL、200μL、20μL。6試劑和耗材6.1人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF細(xì)胞）。6.2HSF細(xì)胞專用培養(yǎng)基。6.30.25%胰蛋白酶（無(wú)菌）。6.4PBS磷酸鹽緩沖液（無(wú)菌）。6.5細(xì)胞劃痕試驗(yàn)插件（無(wú)菌）。7試驗(yàn)步驟7.1體外模型的準(zhǔn)備7.1.1細(xì)胞培養(yǎng)2T/LNPCXXX-2024將人表皮細(xì)胞用胰蛋白酶作用5min-10min后，用專用培養(yǎng)基終止消化，巴氏吸管吹打細(xì)胞使其成為單細(xì)胞懸液。加入適量培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液使其密度約為1×104個(gè)/mL。將劃痕試驗(yàn)插件2孔插件置于24孔板底部，用微量移液器吸取細(xì)胞懸液接種到插件的孔中，然后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約48h。7.1.2制造劃痕待細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度為95%時(shí)，取出插件，底部即產(chǎn)生均一的無(wú)細(xì)胞間隙。7.2給予化妝品原料試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組和化妝品原料組。稱取一定量的化妝品原料，將其用表皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基稀釋到試驗(yàn)濃度。用微量移液器吸干24孔板內(nèi)的培養(yǎng)基；加入0.5mLPBS清洗細(xì)胞一次，再吸干各孔。對(duì)照組每孔加入0.5mL空白培養(yǎng)基，化妝品原料組每孔加入0.5mL含有化妝品原料的培養(yǎng)基。隨后將24孔板置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h。7.3活細(xì)胞成像在給藥后的0h、24h和48h分別對(duì)制造的間隙在顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍攝，并使用軟件對(duì)間隙面積進(jìn)行測(cè)量。8結(jié)果計(jì)算hr：愈合率，%；S終：最終間隙面積；S初：初始間隙面積。9結(jié)果判定符合以下條件說(shuō)明化妝品原料具有修護(hù)功效:與對(duì)照組相比，化妝品原料組的愈合率大于對(duì)照組，且具有顯著性差異（p＜0.05）。3T/LNPCXXX-2024參考文獻(xiàn)[1]國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.