基因工程基本操作過程(目的基因與運(yùn)載體結(jié)合).ppt

1、1、目標(biāo)基因與載體的結(jié)合，是基因工程的基本操作過程，1、2、基因工程，又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，從不同來源的基因按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖在體外構(gòu)建雜交的DNA分子，然后將它們導(dǎo)入活細(xì)胞，改變生物體原有的遺傳特征，獲得新的品種并生產(chǎn)出來?；蚬こ碳夹g(shù)為研究基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了強(qiáng)有力的手段?；蚬こ桃兀喊ㄍ庠碊NA、載體分子、工具酶和受體細(xì)胞等。a，3，1。目標(biāo)基因的提取。目標(biāo)基因與載體的結(jié)合(基因表達(dá)載體的構(gòu)建)是基因工程的核心。3.將靶基因?qū)胧荏w細(xì)胞4。目的基因的檢測和表達(dá)重組DNA技術(shù)的切割、嫁接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、檢測、操

2、作步驟：a、4、a、5。外源DNA片段與載體分子連接的方法，即體外DNA分子重組技術(shù)，主要依靠限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用?；蛑亟M3360使用限制性內(nèi)切酶和其他酶。切割和修飾載體DNA和靶基因以連接它們，將靶基因插入到自我復(fù)制載體中，然后將其轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，以便外源靶基因可以在受體細(xì)胞中被擴(kuò)增或正確表達(dá)。a，6，根據(jù)不同的研究目的，精心設(shè)計(jì)了最終構(gòu)建的重組分子。需要考慮以下兩個(gè)方面。如果研究目的是：(1)為了表達(dá)有價(jià)值的蛋白質(zhì)，選擇合適的調(diào)控序列和終止序列如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，將目標(biāo)基因置于啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的下游，并檢查閱讀框是否正確是非常重要的。(2)為了分析某一基因上游序列的調(diào)節(jié)功能，有

3、必要考慮選擇合適的報(bào)告基因，并將可能具有調(diào)節(jié)功能的靶基因置于報(bào)告基因上游的合適位置。如果調(diào)節(jié)基因可以起到增強(qiáng)子的作用，那么應(yīng)該在報(bào)告基因下游的適當(dāng)位置插入一個(gè)功能基因，從而反映增強(qiáng)子的作用。1.結(jié)扎前準(zhǔn)備，a，7，a，8。為了將目標(biāo)基因重組到載體分子中，需要適當(dāng)處理載體DNA和目標(biāo)基因，以便它們可以相互連接形成新的重組分子。2.結(jié)扎前治療，a，9。載體DNA通常有許多限制性位點(diǎn)，但不是所有的限制性位點(diǎn)都可以用于重組切割。理想的限制性位點(diǎn)應(yīng)滿足以下條件：載體上的特異性限制性位點(diǎn)應(yīng)盡可能少，優(yōu)選單個(gè)限制性位點(diǎn)，以確保目標(biāo)基因和載體DNA以最高概率正確結(jié)合。2)在限制性位點(diǎn)之前應(yīng)該有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，因

4、此3)在基因轉(zhuǎn)錄和連接后翻譯的過程中，所選擇的載體不得改變編碼區(qū)的閱讀框架。1。向量的要求，a，10。當(dāng)用相同的限制性酶切割載體和外源DNA時(shí)，形成的DNA末端可以相互匹配，并且可以通過T4連接酶共價(jià)連接以形成重組分子。然而，當(dāng)目標(biāo)片段的末端與載體不匹配時(shí)，有必要轉(zhuǎn)換一個(gè)或兩個(gè)片段的末端形式以連接它們。這種末端轉(zhuǎn)化通常通過以下三種方式進(jìn)行：3凹端展平：用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分展平3凹端，不匹配的3凹端轉(zhuǎn)化為粘性端；或者完全變平以產(chǎn)生一個(gè)末端鈍的DNA分子，該分子可以與任何其他末端鈍的DNA連接。3-末端切除：T4噬菌體DNA聚合酶具有很強(qiáng)的3-5核酸外切酶活性，可以切除3-

5、末端。平端加合成接頭：合成接頭是兩種化學(xué)合成的寡核苷酸的等摩爾混合物，兩種寡核苷酸相互互補(bǔ)，并且兩種寡核苷酸可以形成具有一個(gè)或多個(gè)限制性酶位點(diǎn)的平端雙鏈體。因此，通過在鈍端DNA上添加接頭，可以在亞克隆操作中添加一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。2.結(jié)扎前處理：末端轉(zhuǎn)換，a，11。載體脫氧核糖核酸和目標(biāo)基因脫氧核糖核酸之間的聯(lián)系。根據(jù)DNA片段的不同末端性質(zhì)，有以下不同的連接方法：粘端連接、平端連接、均聚物加尾連接、人工接頭連接，以及用載體連接三個(gè)基因的四種方法。a 12 1。與相同限制性位點(diǎn)的連接3360由相同限制性內(nèi)切酶切割的不同的DNA片段是完整的只要從酶切割突出的單鏈的粘性末端和酶切割位點(diǎn)附

6、近的DNA序列不影響連接，重組的DNA分子可以在連接酶的作用下形成。上述方法的缺點(diǎn)是限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的帶有粘性末端的載體DNA分子在連接反應(yīng)中經(jīng)常發(fā)生自環(huán)化，并在連接酶的作用下再次成為穩(wěn)定的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)。溶液：線性載體DNA分子用細(xì)菌堿性磷酸酶預(yù)處理以除去其5-末端的磷酸基團(tuán)。(1)粘性末端DNA片段的連接，a，13，a，14，2。不同的限制性位點(diǎn)連接由兩種不同限制性內(nèi)切酶切割的：個(gè)DNA片段，這兩種酶具有相同類型的粘性末端，稱為互補(bǔ)末端。外源DNA和載體DNA被兩種限制性內(nèi)切酶切割后，一邊產(chǎn)生粘性末端，另一邊產(chǎn)生扁平末端(你可以先制造粘性末端，然后再制造扁平末端)。a，15，a，16，雙向消

7、化片段定向克隆的優(yōu)點(diǎn)，外源DNA只能在一個(gè)方向插入重組質(zhì)粒，從而便于靶基因的正確轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。載體與外源性DNA結(jié)合處的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)保留，在被相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割后，可隨時(shí)從重組載體中分離出目的基因。不會(huì)自行循環(huán)，轉(zhuǎn)化率高。大多數(shù)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌克隆攜帶帶有目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒。一些核酸內(nèi)切酶如Hae和Hpa切割的DNA片段沒有粘性末端，但有扁平末端。末端扁平的限制載體只能與末端扁平的目標(biāo)基因連接。T4DNA連接酶可以催化由相同或不同限制性酶切割的鈍端之間的連接。平端連接比粘端連接困難得多，并且其連接效率非常低，約為粘端連接的1%。適用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的鈍端，適用于填充或切割粘性端形成的鈍端

8、。(2)鈍端連接，a，18，a，19，提高鈍端連接效率的方法包括：增加連接酶的量(比粘端連接多10倍)，增加鈍端底物的濃度，增加分子間碰撞的機(jī)會(huì)；加入10%聚乙二醇8000，促進(jìn)大分子之間的有效相互作用；加入一價(jià)陽離子(氯化鈉)。a，20，當(dāng)不可能在載體兩端的限制性位點(diǎn)和外源性DNA片段之間找到合適的匹配時(shí)，解決方法是人工接頭連接：通過依次添加和連接來合成DNA接頭，然后使用限制性酶消化來解決該問題。同源尾連接法：可以通過使用末端轉(zhuǎn)移酶在載體的限制性位點(diǎn)和外源性DNA片段的3個(gè)末端添加互補(bǔ)的同源尾來解決。聚合酶鏈反應(yīng)方法：利用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)擴(kuò)增外源基因片段，從而添加一個(gè)合適限制性酶的單一識(shí)別

9、序列，然后用限制性酶消化來解決這個(gè)問題。a，21，同聚體加尾連接：用末端轉(zhuǎn)移酶將一段寡核苷酸加到載體和外源雙鏈DNA的3個(gè)末端，制成人工粘性末端，不同的寡核苷酸應(yīng)分別加到外源DNA和載體DNA分子上。在脫氧核糖核酸連接酶的作用下，連接成重組脫氧核糖核酸。這種方法可以應(yīng)用于任何來源的DNA片段。然而，該方法很復(fù)雜，需要核酸外切酶、S1核酶和末端轉(zhuǎn)移酶的協(xié)同作用。(3)均聚物拖尾法，A，22，A，23，均聚物拖尾法實(shí)際上是一種人工粘端連接法。優(yōu)點(diǎn)：通過DNA拖尾，不僅可以連接兩個(gè)平端的DNA片段，而且平端的DNA片段也可以與粘端的DNA片段連接。缺點(diǎn)：它只對(duì)質(zhì)粒載體有效；很難控制質(zhì)粒和cDNA上的

10、均聚物的長度，a，24，人工接頭(DNA寡核苷酸連接)是一種合成的短雙鏈DNA序列，具有一個(gè)或幾個(gè)特定的限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割序列。在平端加入新的酶切位點(diǎn)，然后用限制性內(nèi)切酶切掉粘端，進(jìn)行粘端連接。(4)人工接頭連接法，a，25，a，26，優(yōu)點(diǎn)：是一種有效實(shí)用的DNA重組方法，具有均聚物拖尾法和粘端連接法的優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)不同限制性酶位點(diǎn)的人工接頭。如果在體外連接反應(yīng)中增加人工接頭的濃度，平端DNA片段之間的連接效率將大大提高。缺點(diǎn)：如果待克隆的DNA片段或基因也含有與人工接頭相同的限制性酶位點(diǎn)，在消化人工接頭的同時(shí)，會(huì)將克隆的外源基因切割成不同的片段，產(chǎn)生粘性末端，從而給后續(xù)操

11、作帶來麻煩。自從杰克遜等人于1973年在分子生物學(xué)學(xué)會(huì)上首次提出基因可以被人工重組并在細(xì)菌中復(fù)制以來，27歲。此后，基因工程作為一個(gè)新的研究領(lǐng)域迅速發(fā)展，基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究都取得了可喜的成果。這是生命科學(xué)發(fā)展的一次飛躍，進(jìn)入了生物性狀定向快速轉(zhuǎn)化的新時(shí)代，受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。在過去的幾十年中，已經(jīng)進(jìn)行了基因工程研究，并且已經(jīng)建立了多種載體受體系統(tǒng)，它們分別適用于微生物、動(dòng)物和植物的轉(zhuǎn)基因。已經(jīng)克隆了許多有用的靶基因，開發(fā)了幾十種昂貴的基因工程藥物，培育了許多具有特殊特征的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物?；蚬こ坛删停?0世紀(jì)基因工程取得了巨大的進(jìn)步。至少有兩個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)。一個(gè)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物，另一個(gè)是克隆技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物被植入新的基因，這使得動(dòng)物和植物有了它們以前沒有的全新特征，從而引發(fā)了一場農(nóng)業(yè)革命。如今，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，如抗蟲番茄和快速生長的鯽魚。1997年，世界十大科技突破之一是克隆羊的誕生。這只名叫多莉的母羊是第一只通過無性繁殖產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物，它完全繼承了母羊的遺傳基因，正是這些基因賦予了它細(xì)胞核。“克隆”一度成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。盡管存在倫理和社會(huì)問題，生物技術(shù)的巨大進(jìn)步給了人類更廣闊的想象未來的空間。a，29，a，30，現(xiàn)在，一個(gè)國際合作的基因組測序項(xiàng)目已經(jīng)完成。隨著功能基因的不斷發(fā)展，分離和轉(zhuǎn)基因