第二章 功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)與定位.ppt

1、第二章功能性標(biāo)記的發(fā)展和定位，第一節(jié)功能性標(biāo)記的概念和類型，第二節(jié)功能性標(biāo)記的發(fā)展和定位，第一節(jié)功能性標(biāo)記的概念和類型，DNA標(biāo)記多態(tài)性的分子基礎(chǔ)示意圖，分子標(biāo)記在染色體上的分布，外顯子、基因、代表標(biāo)記、1.1功能標(biāo)記的概念，也稱為診斷標(biāo)記，是基于基因內(nèi)部序列的多態(tài)性位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記，其導(dǎo)致具有已知生物功能的表型變異。前提是目標(biāo)基因的生物學(xué)功能已經(jīng)確定。分子標(biāo)記、性狀、基因、重復(fù)序列、同源基因、已知功能、未知功能、連鎖標(biāo)記、功能標(biāo)記、基因標(biāo)記、1.2類功能標(biāo)記、1.2.1 SRAP標(biāo)記序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性、擴(kuò)增多態(tài)性相關(guān)序列。原理：通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增開(kāi)放閱讀框，上游引物長(zhǎng)度為17 bp以特

2、異性擴(kuò)增外顯子；下游引物長(zhǎng)度為18 bp，可特異性擴(kuò)增內(nèi)含子區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)。多態(tài)性是由不同的個(gè)體和不同的內(nèi)含子、啟動(dòng)子和物種間隔長(zhǎng)度造成的。內(nèi)含子，外顯子，外顯子，內(nèi)含子，正向引物，反向引物，1.2.2 SRAP標(biāo)記程序，1引物設(shè)計(jì)上游引物長(zhǎng)度17 bp，外顯子特異性擴(kuò)增；下游引物長(zhǎng)度為18 bp，可特異性擴(kuò)增內(nèi)含子區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)。2反應(yīng)體系和條件，反應(yīng)體系：20L 30 ng DNA模板，0.3mol/l引物，200mol/l dntps，1個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液，1.5mol/l氯化鎂，1 u Taq酶，不足部分用ddH2O補(bǔ)充。反應(yīng)條件：94變性5分鐘，1個(gè)循環(huán)；94變性1分鐘，35復(fù)性1分鐘

3、，72延伸1分鐘，5個(gè)循環(huán)；94變性1分鐘，50復(fù)性1分鐘。72次延長(zhǎng)1.5分鐘，35次循環(huán)；72延伸5 min，3產(chǎn)物檢測(cè)和圖譜分析，4%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，4個(gè)特征，共顯性標(biāo)記系統(tǒng)多態(tài)性強(qiáng)，DNA要求低，成本簡(jiǎn)單，標(biāo)記分布均勻：如果不使用擴(kuò)增區(qū)域序列信息，生成的標(biāo)記是隨機(jī)分布的，嚴(yán)格地說(shuō)，它們不是功能性標(biāo)記。如果SRAP引物是為特定基因設(shè)計(jì)的，它們就被標(biāo)記為功能標(biāo)記。1.2.3 TRAP標(biāo)記、靶區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性、靶區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性或靶區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性。原理：利用生物信息學(xué)工具和科技英語(yǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，我們可以生成目標(biāo)候選基因區(qū)域的多態(tài)性標(biāo)記。TRAP技術(shù)使用兩個(gè)18核苷酸引物產(chǎn)生標(biāo)記，一個(gè)是固定引物，

4、根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)；另一種是隨機(jī)引物，根據(jù)外顯子和內(nèi)含子的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)成富含任意序列的GC或AT核心區(qū)。1引物設(shè)計(jì)，TRAP技術(shù)使用兩個(gè)18核核苷酸引物產(chǎn)生標(biāo)記，一個(gè)是固定引物，根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)；另一種是隨機(jī)引物，根據(jù)外顯子和內(nèi)含子的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)成富含任意序列的GC或AT核心區(qū)。內(nèi)含子、外顯子、外顯子、內(nèi)含子、反向引物、正向引物、2個(gè)反應(yīng)體系和條件、反應(yīng)體系：20L 40 ng DNA模板、0.25 mol/L引物、200mol/L DNA TPS、1個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液、15 mmol/L氯化鎂、1 U Taq酶，不足部分用ddH2O補(bǔ)充。反應(yīng)條件：94變性5分鐘，1個(gè)循環(huán)；94變性1分鐘，3

5、5復(fù)性1分鐘，72延伸1分鐘，5個(gè)循環(huán)；94變性1分鐘，50復(fù)性1分鐘。72次延長(zhǎng)1.5分鐘，35次循環(huán)；72延伸5 min，3產(chǎn)物檢測(cè)和圖譜分析，6.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，1.2.4聚合酶鏈反應(yīng)-DGGE標(biāo)記，基于聚合酶鏈反應(yīng)的變性梯度凝膠電泳標(biāo)記。原理：根據(jù)功能基因域基序的單核苷酸多態(tài)性，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性梯度凝膠電泳分析。聚合酶鏈反應(yīng)程序，巢式或半巢式聚合酶鏈反應(yīng)：TouchDowD94變性4分鐘；退火20個(gè)周期(941分鐘，65561分鐘，721分鐘，2個(gè)周期減少1)；10個(gè)周期(94.1分鐘，55.1分鐘，72.1分鐘)；繼續(xù)延長(zhǎng)，72 6分鐘。圖譜分析，葡萄糖

6、262磷酸脫氫酶(G6PD)，急性白血病胸苷酸合酶(TS)，1.2.5其他功能標(biāo)記，用于內(nèi)含子擴(kuò)增：IFLP:內(nèi)含子片段長(zhǎng)度多態(tài)性ISAP:內(nèi)含子序列擴(kuò)增多態(tài)性SSCP-單核苷酸多態(tài)性：基于單核苷酸多態(tài)性的單鏈核苷酸構(gòu)象多態(tài)性用于啟動(dòng)子擴(kuò)增：PRAP:啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性用于外顯子擴(kuò)增：STS:序列標(biāo)簽位點(diǎn)RGA:抗病基因的相似序列，SSCP-單核苷酸多態(tài)性，SSCP-單核苷酸多態(tài)性，缺失區(qū)的插入，檢測(cè)，微衛(wèi)星區(qū)，檢測(cè)，簡(jiǎn)單序列重復(fù)功能域標(biāo)記(SSS GS3基因第二外顯子的單核苷酸多態(tài)性(CA)功能標(biāo)記與水稻粒長(zhǎng)高度相關(guān)，GS3基因第二外顯子單核苷酸從C突變?yōu)锳導(dǎo)致水稻籽粒生長(zhǎng)。 第二部分是功能

7、標(biāo)記的發(fā)展。原理：引物是根據(jù)已知的功能基因序列變異區(qū)域設(shè)計(jì)的特異性擴(kuò)增引物，擴(kuò)增產(chǎn)物是獨(dú)特的或易于與其他基因區(qū)分。在基因結(jié)構(gòu)中，內(nèi)含子區(qū)、5UTR、3UTR和外顯子更保守。外顯子、內(nèi)含子、CDs(編碼序列)、orf(開(kāi)放閱讀框)、STS功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)，1獲得某一已知功能基因序列，2比較同源序列或等位基因獲得變異區(qū)序列，3設(shè)計(jì)變異區(qū)引物，4特異性擴(kuò)增5分析圖譜，搜索UniGene數(shù)據(jù)庫(kù)(/UniGene/)尋找差異帶，構(gòu)建特定染色體基因組文庫(kù)，隨機(jī)選擇克隆進(jìn)行單個(gè)短片段測(cè)序， 通過(guò)比較確定沒(méi)有重復(fù)序列，在序列上搜索引物，合成引物對(duì)基因組進(jìn)行聚合酶

8、鏈反應(yīng)，產(chǎn)物為單個(gè)片段，即硫-硫標(biāo)記。 確認(rèn)它在染色體上的位置。如：多酚氧化酶基因的STS功能標(biāo)記的發(fā)展，2A染色體上多酚氧化酶基因的STS功能標(biāo)記的分子基礎(chǔ)，2A染色體上多酚氧化酶基因的STS功能標(biāo)記的分子基礎(chǔ)，2D染色體上多酚氧化酶基因的STS功能標(biāo)記的分子基礎(chǔ)。2D染色體上PPO基因的STS功能標(biāo)記為713bp、490bp，PPO29和PPO16是一對(duì)互補(bǔ)標(biāo)記，即PPO29擴(kuò)增后，所有活性高的品種都能擴(kuò)增490bp的條帶，而活性低的品種不能擴(kuò)增；PPO16擴(kuò)增后，所有低活性品種均擴(kuò)增出713bp條帶，而高活性品種則沒(méi)有。第3節(jié)，功能標(biāo)記定位，3.1非整倍體定位技術(shù)，即使用功能標(biāo)記的特異性引物擴(kuò)增和分析相應(yīng)非整倍體物種的基因組，如果哪條染色體或染色體臂沒(méi)有擴(kuò)增出靶帶，則標(biāo)記位于該染色體或染色體臂上。3.2連鎖標(biāo)記技術(shù)，即尋找與功能標(biāo)記緊密連鎖的分子標(biāo)記，計(jì)算重組率，并在連鎖圖上定位功能標(biāo)記。通常，使用的分子標(biāo)記是SSR標(biāo)記。3.3 FISH技術(shù)，即使用功能標(biāo)記擴(kuò)增的序列作為探針，用基因組染色體進(jìn)行熒光原位雜交，具有雜交信號(hào)的染色體為定位染色體。3.4