分子生物學(xué)--蛋白質(zhì).ppt

1、第一章 蛋白質(zhì),第一節(jié) 蛋白質(zhì)的元素組成,特點(diǎn)：含氮量較恒定，一般在16%左右 蛋白質(zhì)系數(shù)6.25 蛋白質(zhì)含量 = 樣品含氮量6.25,第二節(jié) 氨基酸,非蛋白氨基酸（二百余種）,氨基酸,蛋白氨基酸,基本氨基酸,稀有氨基酸,一、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與分類：,1.結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：所有20 種基本氨基酸的結(jié)構(gòu)通式為,特點(diǎn)：-氨基酸 (脯氨酸除外) L-氨基酸（甘氨酸除外）,中文：如 甘氨酸； 英文：三字母符號（Gly）和單字母符號（G）,2.分類：分類原則在生理pH條件下，氨基酸R基的帶電性。 據(jù)此原理，20種氨基酸共分為四組： 非極性R基氨基酸 極性不帶電荷R基氨基酸 帶負(fù)電荷R基氨基酸 （酸性氨基酸） 帶正電荷R

2、基氨基酸（堿性氨基酸）,表示：,3.稀有氨基酸：蛋白質(zhì)合成后在基本氨基酸基礎(chǔ)上經(jīng)加工修飾而生成的氨基酸。,4羥基脯氨酸,賴氨酸,5羥基賴氨酸,二、必需氨基酸（8種）： 人體不能自我合成，必須從外界中攝取的氨基酸,賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、色氨酸,GO,氨基酸 丙氨酸 纈氨酸 亮氨酸 異亮氨酸 苯丙氨酸 色氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸,三字母 符號 Ala Val Leu Ile Phe Trp Met Pro,單字母 符號 A V L I F W M P,非 極 性 R 基 氨 基 酸,結(jié)構(gòu)式,三、氨基酸的理化性質(zhì),1.一般性質(zhì)：溶解度：可溶于水、稀酸、稀堿中 旋

3、光性：丙氨酸 +1.8、半胱氨酸 -16.5、 脯氨酸 -86.0 熔點(diǎn)：大部分在200以上，丙氨酸297、絲氨酸280 2.兩性解離和等電點(diǎn)：氨基酸由酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)，可以發(fā)生兩性解離：,等電點(diǎn)定義：某一氨基酸的凈電荷等于零時的溶液pH值為該氨基酸的等電點(diǎn) 不同的氨基酸有不同的等電點(diǎn) 等電點(diǎn)時的特點(diǎn)：溶解度下降 用途：可根據(jù)氨基酸的等電點(diǎn)來分離不同氨基酸，如味精生產(chǎn)時將pH值調(diào)到3.22，谷氨酸沉淀下來。,pI計算法： pI=（pK左+pK右 ）/2 pK左 : pI處左側(cè)pK 值， pK右 :pI處右側(cè)pK 值。 如：甘氨酸的兩性解離為：,pK1 =2.34 pk2 =9.60 pI=(

4、2.34+9.60)/2=5.97,賴氨酸的兩性解離為：,與等電點(diǎn)有關(guān)的pK值為：pK2 =8.95 pK3 =10.53 pI=9.74 一、二、三組氨基酸：pI=（pK1+pK2 ）/2 第四組氨基酸：pI=（pK2 +pK3 ）/2,3.吸收光譜：所有20種基本氨基酸在可見光區(qū)都無光吸收，在近紫外區(qū)三種芳香氨基酸具有紫外吸收，即：苯丙氨酸257nm、酪氨酸275nm、色氨酸280nm,GO,氨基酸表觀解離常數(shù)和等電點(diǎn),用途：可用于氨基酸的定性和定量測定 脯氨酸是亞氨基酸，只有一步反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為黃色。,4.氨基酸的重要化學(xué)反應(yīng) （1）茚三酮反應(yīng),（2）Sanger反應(yīng) 氨基酸與二硝基氟苯

5、（DNFB）反應(yīng)，生成二硝基苯代氨基酸（DNP氨基酸）,用途：測定肽鏈N-端氨基酸,（3）Edman反應(yīng) 異硫氰酸苯酯與氨基酸反應(yīng)生成PTH氨基酸,用途：蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列測定,5.氨基酸的分離方法 （1）分配層析 固定相，流動相,Rf = B/A Rf ：遷移率,層析缸,層析濾紙,層析液,流動相：正丁醇,固定相：水,溶劑前沿,點(diǎn)樣線,原點(diǎn),氨基酸色點(diǎn),（2）離子交換層析,離子交換劑,配對離子,氨基酸,平衡離子,第三節(jié) 肽,一、概念：,二、書寫方式：左右，N C，可用英文或中文簡寫，中間用一短杠相連，氨基端加“H”，羧基端加“OH”，每一個氨基酸要叫氨基酸殘基。 例： H-丙-甘-谷-精苯丙-

6、組-OH H-Ala-Gly-Glu-ArgPhe-His-OH,主肽鏈 多肽鏈中由共價鍵連接成的連續(xù)的鏈狀結(jié)構(gòu) 肽單位 主肽鏈中的重復(fù)單位,由于有巰基，所以有氧化還原反應(yīng) GSH + GSH GSSG + 2H+ +2e- 谷胱甘肽是生物體內(nèi)重要的氧化還原物質(zhì)，對細(xì)胞起到了保護(hù)作用，另外，還是其他細(xì)胞保護(hù)劑的還原劑,三、重要的寡肽及其作用 谷胱甘肽（GSH）：,第四節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),一、一級結(jié)構(gòu)：定義：蛋白質(zhì)的多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵位置 特點(diǎn)：基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定結(jié)構(gòu) 牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)（局部）：牛胰島素由A、B兩條肽鏈組成，A鏈20個氨基酸殘基，B鏈30個氨基酸殘基,二、二級結(jié)構(gòu)：（

7、1）概念：二級結(jié)構(gòu)定義在規(guī)則氫鍵指導(dǎo)下局部多肽鏈在空間的排列方式 由于單鍵可以自由旋轉(zhuǎn)，所以從理論上說肽鏈有無數(shù)種構(gòu)象，但實(shí)際上，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)只有少數(shù)幾種，這是由于肽鏈在形成空間結(jié)構(gòu)時要受到多種因素的限制，這些因素有：,肽鍵平面由于肽鍵的雙鍵性質(zhì)，使得形成肽鍵的N、C原子以及它們相連的四個原子形成一個平面，這個平面就叫肽鍵平面。,形成的原因：p共軛，肽鍵不能自由旋轉(zhuǎn) 結(jié)果：形成剛性平面,二面角 和兩個構(gòu)象角稱為二面角,非鍵合原子之間最小接觸距離 （nm）,非鍵合原子之間最小接觸距離,a螺旋：要點(diǎn)：單鏈、右旋，一圈3.6殘基，上升0.54nm，形成51氫鍵且全部平行，R基指向外側(cè),（2）種類

8、（4類）：,折疊：肽鏈伸展，形成鏈間氫鍵（成為片層），R-基處于片層上下,反平行b折疊,折疊有平行和反平行兩種, 轉(zhuǎn)角（回折）：肽鏈180旋轉(zhuǎn)，氫鍵連接；,無規(guī)則卷曲,轉(zhuǎn)角,三、超二級結(jié)構(gòu)：概念：相鄰二級結(jié)構(gòu)單元 相互作用形成的聚合體,種類：（A） X(B、C) 曲折（D） 回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(E),四、結(jié)構(gòu)域：概念：蛋白質(zhì)分子中在空間相對獨(dú)立的三維實(shí)體。,乳酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域,刀豆蛋白結(jié)構(gòu)域,彈性蛋白酶三級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域,免疫球蛋白G,例：肌紅蛋白。是肌肉中運(yùn)輸氧的蛋白質(zhì)，一條肽鏈，153個氨基酸殘基，分子量為16700，含一個血紅素輔基，氧分子就結(jié)合在它的鐵上。整個分子有8個-螺旋，并且有-轉(zhuǎn)角和無規(guī)

9、則卷曲，但是無-折疊 。,又如：卵溶菌酶,五、三級結(jié)構(gòu)：定義：蛋白質(zhì)分子中所有原子的空間排列,特點(diǎn)： 高低不平,IgG的結(jié)構(gòu),疏密不一 近似球狀,醛糖脫氫酶, 外親內(nèi)疏,如：血紅蛋白含有四個亞基，為22，每個亞基含一個血紅素，每個血紅素可結(jié)合一個氧分子。亞基含141個氨基酸殘基，亞基含146個氨基酸殘基。,亞基與肽鏈的區(qū)別，亞基 是指寡聚蛋白中非共價連接的亞單位，它可以是一條肽鏈，也可以是通過共價鍵連接起來的幾條肽鏈。 亞基和原體 原體是指寡聚蛋白中等同的結(jié)構(gòu)成分，有時原體就是一個亞基，但有時是幾個亞基。如血紅蛋白的亞基數(shù)為四個，但其原體數(shù)為二個。,Hemoglobin空間結(jié)構(gòu),六、四級結(jié)構(gòu)：

10、概念：蛋白質(zhì)分子中亞基在空間的排列,氫鍵、鹽鍵、疏水作用力、二硫鍵、配位鍵、范德華引力,七、維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力,一、蛋白質(zhì)的功能：催化、運(yùn)轉(zhuǎn)、運(yùn)動、能量交換、免疫、激素、調(diào)節(jié)、結(jié)構(gòu)、貯存 二、一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：一級結(jié)構(gòu)與功能有密切的關(guān)系 1. 氨基酸對功能的重要性 如果改變的氨基酸是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能所必需的，則這種氨基酸的改變對功能的影響極大，如果改變的氨基酸對功能無貢獻(xiàn)，則它們的改變基本不影響蛋白質(zhì)的功能。 如RNA酶，如果將其N-端的三個氨基酸去掉，酶的功能基本不變，但是，如果將組12改變，則酶失去活性。,第五節(jié) 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,鐮刀狀貧血病：就是由于血紅蛋白-鏈上第六位的谷氨

11、酸被纈氨酸代替，使得血紅蛋白分子在氧分壓低的情況下容易聚合，形成桿狀多聚體，致使紅細(xì)胞由正常的圓盤狀成為鐮刀狀，血液流動受到阻礙。,正常血紅細(xì)胞,鐮刀型血紅細(xì)胞,分子病 這種由于遺傳突變引起的蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而產(chǎn)生的疾病稱為分子病。,同源蛋白：不同生物中具有同一功能的蛋白質(zhì)。它們的特點(diǎn)是其一級結(jié)構(gòu)中，與功能直接相關(guān)的殘基相同，而其它殘基有差異，這些殘基是可以改變的，這種變化往往與生物進(jìn)化有關(guān)。例：Cytc與進(jìn)化 生 物 殘基改變數(shù) 生 物 殘基改變數(shù) 生 物 殘基改變數(shù) 黑猩猩 0 狗 11 狗魚 23 恒河猴 1 騾 11 蛾 31 兔 9 馬 12 小麥 35 袋鼠 10 雞、火

12、雞 13 面包霉 43 鯨 10 響尾蛇 14 酵母 44 牛、豬、羊 10 韌齒龜 15,2. 種屬差異與分子進(jìn)化,一定的結(jié)構(gòu)，一定的功能,結(jié)構(gòu)變化，功能變化,結(jié)構(gòu)破壞，功能破壞,三、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,第六節(jié) 蛋白質(zhì)性質(zhì) 一、兩性解離與等電點(diǎn)：,概念：蛋白質(zhì)凈電荷等于零時的環(huán)境pH值。不同蛋白質(zhì)其等電點(diǎn)不同：胃蛋白酶：1.02.5；胰島素：5.35.35；血紅蛋白：7.07；魚精蛋白：12.012.4 特點(diǎn)：溶解度降低，可用于蛋白質(zhì)的分離 電泳：大分子化合物在電場中運(yùn)動的過程。 原理：不同蛋白的電荷正負(fù)和數(shù)量不同，分子量不同，形狀不同，因此在電場中的運(yùn)動速度不同。 方向與速度的鑒別：pI

13、 pH，正負(fù)為方向，數(shù)值為速度。 用途：分離鑒定蛋白質(zhì)等大分子化合物,根據(jù)載體的不同，電泳有膜電泳、凝膠電泳等 如：人血清蛋白的醋酸纖維膜電泳圖譜。,現(xiàn)有一混合蛋白質(zhì)樣品，內(nèi)含A、B、C、D三種蛋白，其等電點(diǎn)分別為：A 10.8 B 7.5 C 5.6 D 3.2，指出在pH7.5的緩沖液中電泳時，它們各自的位置。 根據(jù)pI pH，結(jié)果為：A 10.8 7.5 = 3.3 B 7.5 7.5 = 0 C5.6 7.5 = 1.9 D 3.2 7.5 = 4.3 它們電泳后的位置為：,凝膠電泳,例題,蛋白質(zhì)分子量小的幾萬，大的可達(dá)幾百萬，其大小為1100nm，已經(jīng)達(dá)到膠體質(zhì)點(diǎn)的范圍，同時，蛋白質(zhì)

14、分子外表為親水表面，所以，蛋白質(zhì)屬于親水膠體，并且是穩(wěn)定的膠體。 穩(wěn)定因素：水化膜，同種電荷,+,二、膠體性質(zhì),+,但是穩(wěn)定是相對的，如果改變條件其穩(wěn)定性就會發(fā)生變化，如加入有機(jī)溶劑則會脫去水化膜，改變p就會改變其電荷。,透析：大分子化合物不能通過半透膜的性，可用于蛋白質(zhì)脫鹽,沉降：在強(qiáng)離心場中，大分子化合物向離心力方向移動的現(xiàn)象,沉降系數(shù)（s）：單位離心場強(qiáng)單位時間內(nèi)蛋白質(zhì)的沉降距離，其單位是S（注意s與S的區(qū)別），如某蛋白的沉降系數(shù)為70，則表示為70S。 蛋白質(zhì)S值的大小可以近似表示蛋白質(zhì)分子量的相對大小。,三、變性：,概念：物理化學(xué)因素影響，空間結(jié)構(gòu)破壞，性質(zhì)改變，功能喪失,核糖核酸酶

15、的變性過程,因素：物理：熱、高能射線，振動；化學(xué)：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、變性劑。 原因：空間結(jié)構(gòu)破壞。 性質(zhì)改變：溶解度下降，反應(yīng)活性改變。 標(biāo)志：生物活性喪失,鹽析：高濃度中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀的現(xiàn)象 原因：破壞了穩(wěn)定膠體的兩個因素,四、沉淀：,靜電荷為零,優(yōu)點(diǎn)：不影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，常用于蛋白質(zhì)分離 常用的鹽類：硫酸銨和氯化鈉 鹽溶：低濃度中性鹽使蛋白質(zhì)溶解度增加的現(xiàn)象 變性沉淀； 沉淀劑沉淀：有機(jī)溶劑、重金屬鹽、某些酸類，如苦味酸、三氯乙酸； 相互沉淀,280nm，由于有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸,可用于蛋白質(zhì)含量的測定 6.呈色反應(yīng)：茚三酮反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng)：可用于蛋白質(zhì)含量的測定（540nm）,5.紫外吸收：,一、蛋白質(zhì)的提取的預(yù)處理 細(xì)胞的破碎，保持低溫，控制