造血干細(xì)胞的研究及應(yīng)用.ppt

1、造血干細(xì)胞的研究與應(yīng)用,一：造血干/祖細(xì)胞的研究 1.造血活動(dòng)與造血假設(shè) 2.造血干細(xì)胞與造血祖細(xì)胞 3.造血干/祖細(xì)胞的性能測(cè)試 4.造血干/祖細(xì)胞的分離純化 5.造血祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增與定向誘導(dǎo)分化 二.造血干祖細(xì)胞的應(yīng)用與前景,內(nèi)容,造血活動(dòng),血細(xì)胞的生成 在胎兒，血細(xì)胞的生成開(kāi)始于卵黃囊（02月），之后，在肝臟和脾臟（27月），骨髓（59月）為造血的主要場(chǎng)所。出生后，骨髓成為終身造血的大本營(yíng)。,血細(xì)胞類型與壽命 類型 1.淋巴系細(xì)胞： B淋巴細(xì)胞,T淋巴細(xì)胞 2.髓系細(xì)胞: 單核/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞，巨核細(xì)胞，紅細(xì)胞 3.血小板 壽命 人類紅細(xì)胞120d,中性粒細(xì)胞36 h,血小板9.6d

2、,造血假設(shè),以上事實(shí)都支持了這樣的假設(shè)：在造血細(xì)胞中存在著一類原始的造血干細(xì)胞，它們能自我更新，并向各系細(xì)胞分化，從而維持機(jī)體正常的造血功能，使人體有恒定的血細(xì)胞數(shù)量。,一 造血干細(xì)胞（HSC）,概念的提出： 1. 20世紀(jì)50年代，Lorentz等的骨髓移植實(shí)驗(yàn)成功，表明在造血細(xì)胞中存在一類原始的造血細(xì)胞即造血干細(xì)胞。,2. 1961年，Till和McCulloch發(fā)現(xiàn)將正常小鼠的骨髓細(xì)胞輸注給受致死劑量X線照射小鼠，經(jīng)911天后，受者小鼠脾臟表面生成了肉眼可見(jiàn)的由骨髓紅系細(xì)胞，粒系細(xì)胞，巨核系細(xì)胞或三者混合組成的脾集落，又稱脾結(jié)節(jié)。每一個(gè)脾集落稱為一個(gè)脾集落生成單位（CFU-S)。,應(yīng)用染

3、色體C帶顯色和單個(gè)脾集落移植技術(shù)證明，每個(gè)脾集落中的細(xì)胞都是起源于單一細(xì)胞，通過(guò)它的增殖和分化而形成集落。這類生成脾集落的原始細(xì)胞稱為脾集落生成細(xì)胞，它具備了多能造血干細(xì)胞或淋巴系-髓系干細(xì)胞的基本特性。 脾集落生成細(xì)胞是一類最早被認(rèn)識(shí)的造血干細(xì)胞，也是目前惟一能被測(cè)試的一類造血干細(xì)胞。然而，各個(gè)脾集落生成細(xì)胞的功能又是不均一的。,造血干細(xì)胞（HSC）與造血祖細(xì)胞（HPC）,HSC 主要區(qū)別：高度的自我更新和維持能力 不能擴(kuò)增 在體內(nèi)長(zhǎng)期或永久地重建造血，永不消亡,HPC 高度擴(kuò)增能力 部分早期HPC和全部的晚期HPC喪失自我更新和自我維持能力 分化到終末必然調(diào)亡,關(guān)系： HSC,HSC 所有

4、特征不變 HPC 邊增殖邊分化來(lái)維持成熟血細(xì)胞的數(shù)量,造血干/ 祖細(xì)胞的性能測(cè)試,造血干細(xì)胞性能測(cè)試 1.經(jīng)典方法-脾集落測(cè)試法 2.HSC的自我更新和造血重建能力的測(cè)試 3.HSC的無(wú)限增殖和多向分化能力的測(cè)試 造血祖細(xì)胞性能測(cè)試,Till和McCulloch于1961年建立的脾集落技術(shù)到目前為止只能應(yīng)用于小鼠等嚙齒類動(dòng)物，諸如兔，犬和人等均不能用這一方法檢測(cè)。只能通過(guò)測(cè)定造血祖細(xì)胞的數(shù)量來(lái)相對(duì)說(shuō)明造血干細(xì)胞的數(shù)量，至于性能則更難說(shuō)明。 一般利用一些具有細(xì)胞遺傳標(biāo)志的HSC來(lái)生成脾集落，根據(jù)脾集落遺傳標(biāo)志的情況來(lái)研究造血干細(xì)胞的性能，主要有兩種細(xì)胞遺傳標(biāo)志： 1.輻射誘發(fā)的畸變?nèi)旧w：可能對(duì)

5、細(xì)胞的正常增殖與分化有影響，因此很難評(píng)估造血干細(xì)胞的性能。 2.吳祖澤等利用天然性染色體作為細(xì)胞遺傳標(biāo)志,1.經(jīng)典方法-脾集落測(cè)試法,2.HSC的自我更新和造血重建能力的測(cè)試,早期，根據(jù)存在于骨髓，脾臟及肝臟等造血組織和器官中，以及的形態(tài)類似于淋巴細(xì)胞等特點(diǎn)，通過(guò)分離單個(gè)核細(xì)胞，以此群體細(xì)胞的特性研究來(lái)推測(cè)的性能。 人類移植技術(shù)的成功，無(wú)疑是對(duì)人類HSC具有自我更新能力和長(zhǎng)期造血重建能力的最有力證明。 隨著現(xiàn)代化技術(shù)手段的迅猛發(fā)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)的發(fā)展為HSC的研究提供了很好的模型，為性能研究提供了更為直接的證據(jù)。,動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,1.HSC 羊胎內(nèi)移植 2.重癥聯(lián)合免疫缺陷癥(SCID) 或人

6、免疫缺陷（HID）小鼠體內(nèi)移植 3. SCID-Hu Thymus 動(dòng)物模型體內(nèi)移植 4.SCID-Hu Bone動(dòng)物模型體內(nèi)移植,4.SCID-Hu Bone動(dòng)物模型體內(nèi)移植 （1）先將一小段人胎肱骨埋于 SCID小鼠皮下，約8周后移植物的血管已基本長(zhǎng)好。 （2）小鼠經(jīng)射線全身照射后，把HLA不相符合的人類HSC待測(cè)樣品立即注射到移植物的骨髓腔內(nèi)。 （3）再過(guò)8周，取出移植物，一部分樣品用作檢測(cè)骨髓腔內(nèi)細(xì)胞中的人類HSC和HPC，另一部分樣品再一次注入第二個(gè)受射線照射的帶有人肱骨移植物的SCID-HU Bone 動(dòng)物模型體內(nèi)。 （4）再過(guò)8周，檢測(cè)第2次移植物內(nèi)是否有人類HSC，早期HPC，

7、髓系祖細(xì)胞，B細(xì)胞祖細(xì)胞及其前體細(xì)胞，便可證明注入第1個(gè)胎骨移植物的原始樣品是否含有高度自我更新能力的人類造血干細(xì)胞。,3.HSC的無(wú)限增殖和多向分化能力的測(cè)試,早期研究還是以脾集落入手。1984年，吳祖澤等以天然性染色體作為標(biāo)志物，研究了小鼠骨髓中HSC的增殖與分化特性。具體過(guò)程如下： （1）取與受體小鼠性別相反的正常小鼠骨髓的有核細(xì)胞輸入到經(jīng)致死劑量射線照射的受者小鼠，第13天后，受者小鼠生成脾集落。 （2）之后將取自一個(gè)脾集落的細(xì)胞輸入到經(jīng)致死劑量射線照射的，與第一受者小鼠性別相同的第二受者小鼠體內(nèi)，經(jīng)過(guò)78周后，測(cè)試第二受者小鼠脾，淋巴結(jié)的T 細(xì)胞，B細(xì)胞,骨髓中的細(xì)胞及脾集落的雄，雌

8、核型分布，并將其骨髓細(xì)胞輸注到經(jīng)致死劑量照射的，與第一，二受者小鼠性別相同的第三受者 （3）經(jīng)8周后再測(cè)試第三只受者小鼠脾，淋巴結(jié)的T細(xì)胞，B細(xì)胞，骨髓中的細(xì)胞及脾集落的雌，雄核型分析。,結(jié)果表明： 1.通過(guò)最初一個(gè)脾集落生成細(xì)胞在第一受者小鼠脾臟內(nèi)生成的一個(gè)脾集落，在第二，三受者小鼠中不斷增殖，脾集落生成細(xì)胞在數(shù)量上以指數(shù)形式不斷增加。每一個(gè)脾集落都是單一細(xì)胞增殖和分化的結(jié)果。 2.脾集落生成細(xì)胞不僅在經(jīng)射線照射的受者小鼠內(nèi)具有重建髓細(xì)胞的能力，同時(shí)，也具有重建淋巴組織中T細(xì)胞，B細(xì)胞的能力。,隨著各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段的不斷發(fā)展 裴雪濤等利用FACS自動(dòng)細(xì)胞分選系統(tǒng)分選出單個(gè)CD34+細(xì)胞亞群細(xì)

9、胞CD34+CD38+及CD34+CD38-，在96孔板無(wú)血清體系中加入各種細(xì)胞因子（如SCF,IL,GM-CSF,G-CSF及EPO）刺激，進(jìn)行培養(yǎng)。 結(jié)果表明: CD34+CD38-單個(gè)細(xì)胞可形成原代集落，并可向紅系，粒系，巨噬系，巨核系等細(xì)胞分化。并證明了它的性能接近于造血干細(xì)胞，同時(shí)也證明了HSC具有多向分化的能力。,造血祖細(xì)胞性能測(cè)試,起始于1965年P(guān)luznik和Sachs建立的小鼠骨髓細(xì)胞體外瓊脂培養(yǎng)技術(shù)。即在CSF 的作用下，造血細(xì)胞可在瓊脂上形成集落，每一個(gè)集落稱為一個(gè)集落生成單位。（CFU）. 造血細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，在不同刺激因子的作用下，可形成人們可以辨認(rèn)的各系細(xì)胞。生

10、成各系集落的細(xì)胞被稱為各系的祖細(xì)胞，或各系的集落生成細(xì)胞（CFC）,如粒系-巨噬系祖細(xì)胞或稱粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落生成細(xì)胞（CFC-GM）。,培養(yǎng)體系如下：有核細(xì)胞+培養(yǎng)液 3.9ml 馬血清 2.5ml GM-CSF 0.8ml(2U) 5%瓊脂 0.4ml,人們可以根據(jù)各系祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)，對(duì)其性能加以研究。近年來(lái)HSC/HPC表面標(biāo)志（即CD抗原）研究的發(fā)展大大促進(jìn)他們的分離，純化，鑒定及性能等研究。CD34抗原表達(dá)一直持續(xù)到晚期HPC。用CD33,CD38,HLA-DR及系特異性單克隆抗體（Lin）可進(jìn)一步精選HSC和HPC。,近年來(lái)，對(duì)造血干細(xì)胞的深入研究表明，HSC除了具有自我更新和

11、多向分化的基本特性外，還具有以下特點(diǎn): 1.絕大多數(shù)干細(xì)胞處于Go期 2.高度表達(dá)CD34和CDw90抗原 3.缺乏 CD33，CD71等系相關(guān)抗原 4.具有 HLA,CD45RA高相對(duì)分子質(zhì)量形式 5.低表達(dá)或不表達(dá)HLA-DR 6.羅丹明123 低吸收率,Rh123可選擇性的結(jié)合在各種活細(xì)胞的線粒體上，增殖的細(xì)胞都含有更多更大更活躍的線粒體，故可吸收RH123，顯示明亮的熒光,目前認(rèn)為，高增殖潛能集落生成細(xì)胞（HPP-CFC）和長(zhǎng)期培養(yǎng)啟動(dòng)細(xì)胞（LTC-IC）為早期的造血祖細(xì)胞。 HPP-CFC的性能： 研究表明：可以在體外形成較大的集落，自我更新能力比 CFU-Mix 更強(qiáng)，細(xì)胞多處于靜

12、止?fàn)顟B(tài)，很少進(jìn)入增殖周期，對(duì)細(xì)胞周期S期毒劑有耐受性。在較晚時(shí)期形成集落的細(xì)胞則為更為早期的細(xì)胞。 有如下特性： 1.具有體內(nèi)外抗細(xì)胞毒藥物5-Fu的作用 2.可重建受致死劑量射線照射小鼠的骨髓造血 3.具有向巨噬系，紅系，粒系以及巨核系等多向分化的潛能 4.應(yīng)答各種細(xì)胞因子,長(zhǎng)期培養(yǎng)啟動(dòng)細(xì)胞（LTC-IC)是指在長(zhǎng)期培養(yǎng)體系中培養(yǎng)5周后所測(cè)得的集落細(xì)胞，到目前為止，長(zhǎng)期培養(yǎng)體系是模仿人體內(nèi)造血微環(huán)境的最佳體外模式。LTC-IC在有基質(zhì)細(xì)胞層的培養(yǎng)中可以維持造血達(dá)幾個(gè)月。 最近又發(fā)現(xiàn)了較LTC-IC更為原始的造血祖細(xì)胞群延長(zhǎng)長(zhǎng)期培養(yǎng)啟動(dòng)細(xì)胞（ELTC-IC），增殖期出現(xiàn)晚，生成更多的子細(xì)胞。,

13、4.造血干/祖細(xì)胞的分離純化,方法: 造血干 /祖細(xì)胞在增殖，分化過(guò)程中表面抗原的變化是其分離純化的標(biāo)志，而高親和力單克隆抗體的制備和相關(guān)分離純化技術(shù)的完善是其基礎(chǔ)。其中，CD34抗原是HSC/HPC分離純化的主要標(biāo)志。,CD34細(xì)胞及其亞群的分離純化與性能,細(xì)胞表面 CD34抗原是高度糖基化型膜蛋白，主要存在于幼稚造血干/祖細(xì)胞，部分骨髓基質(zhì)細(xì)胞和少量的內(nèi)皮細(xì)胞表面，其表達(dá)的水平與細(xì)胞的分化密切相關(guān)。 目前用于CD34細(xì)胞純化的方法主要有： 1.熒光激活細(xì)胞分選（FACS） 2.免疫吸附分離 （1）單克隆抗體鋪展貼壁 （2）生物素-抗生物素免疫親和層析吸附 （3）免疫磁珠細(xì)胞分選 3.利用細(xì)

14、胞物理學(xué)特性分離 （1）密度梯度離心 （2）淘洗離心,一：CD34+細(xì)胞的陰性富集,定義：利用各種方法去除成熟的血細(xì)胞和免疫活性細(xì)胞，從而達(dá)到HSC/HPC 的富集。 方法： 1.使用不同密度梯度的Ficoll，Percoll淋巴細(xì)胞分離液富集單個(gè)核細(xì)胞（MNC），會(huì)得到明顯的富集。 2.淘洗離心技術(shù) 3.利用花生凝集素和大豆凝集素富集。 由于這幾種富集方法均屬非特異性分離，分選細(xì)胞的純度和產(chǎn)率均較低。故目前極少用于CD34+細(xì)胞的富集。,CD34+細(xì)胞的陽(yáng)性富集,定義：直接利用 HSC /HPC在增殖，分化過(guò)程中表面抗原的變化，通過(guò)其特異性單克隆抗體將其分離純化出來(lái)，從而達(dá)到的富集，即為陽(yáng)性

15、富集。 方法： 1.FACS分選可獲得高純度的CD34+細(xì)胞，并可對(duì)其他方法分選的靶細(xì)胞進(jìn)行純度檢測(cè)和25個(gè)參數(shù)同時(shí)標(biāo)志的亞群細(xì)胞進(jìn)行分選。但該儀器價(jià)格昂貴，分選速率較慢，因此主要用于CD34+細(xì)胞亞群（如CD34+CD38-,CD34+HLA-DR-等）的分選。 2.廣泛應(yīng)用于CD34+細(xì)胞純化的方法是抗CD34單克隆抗體介導(dǎo)的免疫吸附，這類方法具有分離速度快，純度高，分離細(xì)胞量大以及經(jīng)濟(jì)和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。,例如： 利用FACS對(duì)不同來(lái)源的造血細(xì)胞進(jìn)行CD34和CD38雙標(biāo)志參數(shù)分析和分選。得到CD34+CD38+和CD34+CD38-兩個(gè)亞群在骨髓，臍帶血和外周血MNC中所占的比例明顯不同

16、。 結(jié)果表明：CD34+CD38+細(xì)胞大多處于造血祖細(xì)胞階段，可形成大量的各系造血細(xì)胞集落，但不能維持長(zhǎng)期造血；而CD34+CD38-細(xì)胞則更幼稚或更接近于造血干細(xì)胞。,造血祖細(xì)胞體外擴(kuò)增與定向誘導(dǎo)分化,造血祖細(xì)胞體外擴(kuò)增 不同的造血因子組合，SCF加IL-1,IL-3,IL-6,EPO 等可刺激造血細(xì)胞擴(kuò)增。但是，這些細(xì)胞因子的組合在擴(kuò)增造血細(xì)胞的同時(shí)也明顯地加速了造血干/祖細(xì)胞的分化，到21天時(shí)絕大部分細(xì)胞已分化成為較成熟的血細(xì)胞。 因此，如何在擴(kuò)增造血細(xì)胞的同時(shí)，又盡可能地保留造血干細(xì)胞，并擴(kuò)增早期造血祖細(xì)胞，使其在數(shù)量上和功能上滿足臨床治療的需要，這就成為體外擴(kuò)增研究的重點(diǎn)。,今年來(lái)，

17、經(jīng)過(guò)各國(guó)學(xué)者的不斷努力，這方面的研究已取得了明顯的進(jìn)展。 1.造血生長(zhǎng)因子的合理組合。 早期造血細(xì)胞的細(xì)胞因子（SCF，IL-3，GM-SCF） 抑制細(xì)胞凋亡的存活因子（SCF，IL-1，IL-6） 晚期系特異性細(xì)胞因子（G-CSF，EPO，TPO） 2.CD34+CD38-亞群造血祖細(xì)胞的擴(kuò)增 3.造血負(fù)調(diào)控因子的應(yīng)用 例如：利用TGF-，TNF-，白血病抑制因子阻止細(xì)胞分化的作用。 4.基質(zhì)細(xì)胞支持的體外擴(kuò)增 5.持續(xù)灌注培養(yǎng)體系,造血祖細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化,利用造血干/ 祖細(xì)胞具有多向分化的潛能，通過(guò)細(xì)胞因子的不同組合，定向地誘導(dǎo)其分化，產(chǎn)生大量所需的功能細(xì)胞（如紅細(xì)胞，粒細(xì)胞，血小板，樹(shù)突狀細(xì)胞），以滿足基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的需要，這在新一代的細(xì)胞免疫治療中將具有十分重要的意義。 例如：粒系細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化 利用SCF加IL-3，G-CSF，GM-CSF或TPO的組合誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞向粒系細(xì)胞分化。,造血祖細(xì)胞體外擴(kuò)增及定向誘導(dǎo)分化的應(yīng)用前景,1.造血祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增 （1）外周血干細(xì)胞移植時(shí)減少動(dòng)員次數(shù)和分離時(shí)間。 （2）自體造血干細(xì)胞移植時(shí)的腫瘤進(jìn)化。 （3）臍帶血造血干細(xì)胞移植 （4）造血干細(xì)胞作為靶細(xì)胞的基