藥物蛋白質(zhì)組學(xué).ppt

1、第三講藥物蛋白質(zhì)組學(xué)，1。藥物蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)組學(xué)在藥理學(xué)中的應(yīng)用的概念和研究內(nèi)容。藥物蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)組學(xué)和藥學(xué)的學(xué)科交叉并逐漸形成一個新的研究領(lǐng)域。研究內(nèi)容：臨床前：發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點(diǎn)和針對這些靶點(diǎn)的所有可能的化合物，用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究藥物作用機(jī)制和毒理學(xué)臨床研究：作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標(biāo)志，采用類似藥物遺傳學(xué)的方法，根據(jù)蛋白質(zhì)譜對患者進(jìn)行分類，給予個體化治療，預(yù)測藥物療效。運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)策略尋找與藥物作用相關(guān)的蛋白質(zhì)；第二，研究藥物作用靶點(diǎn)，通過研究和比較疾病或藥物的差異蛋白表達(dá)譜，可以發(fā)現(xiàn)影響疾病或藥物的關(guān)鍵蛋白或生化途徑，進(jìn)而綜合分析蛋白的生物學(xué)功能

2、，推測新的和潛在的藥物作用靶點(diǎn)?；钚孕》肿铀幬锼幬锇袠?biāo)的直接發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)：蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，小分子藥物與蛋白質(zhì)直接相互作用，如親和層析、酵母三雜交、蛋白質(zhì)芯片、噬菌體展示技術(shù)、基于蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)組學(xué)方法和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等。研究藥物作用靶點(diǎn)的策略和方法，通過差異表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)基于活性的蛋白質(zhì)譜(ABPP)、親和層析、直接分離活性小分子、結(jié)合蛋白、酵母三雜交系統(tǒng)、藥物靶點(diǎn)的鑒定、噬菌體展示技術(shù)，通過差異表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn)；2.基于活性的蛋白質(zhì)譜(ABPP)分析，基于活性的探針(ABPs):設(shè)計(jì)有結(jié)合/反應(yīng)基團(tuán)和分析標(biāo)簽(如熒光素)的探針分子僅結(jié)合蛋白質(zhì)(酶)的活性形式，因此可以通過測量熒光能

3、量間接確定蛋白質(zhì)活性。其優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)結(jié)合或蛋白質(zhì)表達(dá)水平的測定被酶活性的測定所代替，PNAS 2002年8月6日第99卷第16期1033510340，自然422，226-232(2003年3月13日)。3.親和層析直接分離活性小分子的結(jié)合蛋白。其基本原理是活性小分子配體的一些官能團(tuán)(羧基或氨基)通過連接臂與水不溶性載體(樹脂或瓊脂糖珠)連接作為固定相，制備親和吸附柱。然后，蛋白質(zhì)提取物或細(xì)胞裂解物通過親和柱，未結(jié)合的蛋白質(zhì)用緩沖溶液充分洗滌，與小分子配體親和結(jié)合的蛋白質(zhì)留在柱上；最后，結(jié)合到親和柱上的蛋白質(zhì)被干擾配體和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間相互作用的條件溶液解吸(例如蛋白質(zhì)變性溶液或與游離配體的競爭性

4、結(jié)合)。洗脫的蛋白質(zhì)通常可以通過凝膠電泳進(jìn)行鑒定，然后用質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，或者消化成肽，然后用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀或免疫分析法進(jìn)行分析。Yamamoto等人通過連續(xù)親和層析成功分離并鑒定了免疫抑制劑FK506的特異性結(jié)合蛋白FKBP12。肛門生物化學(xué)。2006年5月1日；352(1):15-23。Bach等人通過相同的方法成功地鑒定出抗癌藥Roscovitine可以特異性結(jié)合多種細(xì)胞內(nèi)激酶CDK5、ERK1和ERK2。生物化學(xué)。2005年9月2日；280(35):31208-19。4。酵母三雜交系統(tǒng)識別藥物靶標(biāo)，酵母雙雜交系統(tǒng)廣泛用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。在此基礎(chǔ)上開發(fā)的酵母三雜交系統(tǒng)將

5、應(yīng)用于蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)核糖核酸和蛋白質(zhì)小分子化合物等更廣泛的研究領(lǐng)域。BD:脫氧核糖核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域AD:轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域DHFR:二氫葉酸還原酶MTX:甲氨蝶呤，一個成功的例子，貝克爾等人首先通過連接臂共價連接CDK抑制劑purvalanol B和MTX聚乙二醇，然后將該化合物添加到酵母表達(dá)DHFR-BD融合蛋白和激酶cDNA文庫AD融合蛋白，以檢測報(bào)告基因的表達(dá)。鑒定了嘌呤醇B的已知靶蛋白CDK1、CDK5和CDK6。同時，在Chem Biol中還發(fā)現(xiàn)了新的激酶靶蛋白CDC/CDK樣蛋白CDC樣激酶3(CLK3)、PCTAIRE蛋白激酶1(PCTK1)和PCTK2、絲/蘇氨酸激酶p21(CDKN

6、1A)活化激酶4(PAK4)、核糖體蛋白S6激酶3(RSK3)、非受體酪氨酸激酶FYK和山口肉瘤癌基因(YES)、受體酪氨酸激酶ephrin受體。2004年2月；11(2):211-23 Licitra通過酵母三雜交系統(tǒng)成功地證實(shí)了fkbp12 (FK506結(jié)合蛋白)美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)1996年11月12日；93(23):12817-21。第三，藥物蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床診斷和治療中的應(yīng)用可以篩選出疾病特異性蛋白，作為疾病分類和臨床診斷的標(biāo)志，也可以作為評價藥物療效和預(yù)測疾病預(yù)后的依據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)個體化藥物治療。1.尋找用于診斷的疾病特異性生物標(biāo)志物，并預(yù)測疾病的預(yù)后和結(jié)果。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以動態(tài)、完

7、整地觀察疾病發(fā)生過程中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的變化。通過比較正常和疾病狀態(tài)下的蛋白質(zhì)表達(dá)，可以識別疾病特異性生物標(biāo)志物。生物標(biāo)志物：一種客觀測量和評估的特征，作為正常生物過程、致病過程或?qū)χ委煾深A(yù)的藥理反應(yīng)的指標(biāo)。美國食品和藥物管理局草擬的用于疾病分期的藥物基因組學(xué)指導(dǎo)診斷工具疾病狀態(tài)的指標(biāo)預(yù)測和/或監(jiān)測對干預(yù)的臨床反應(yīng)，生物標(biāo)記物，生物標(biāo)記物是循證醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)-誰應(yīng)該治療，如何治療，用什么治療。如果沒有新的標(biāo)記物，在更有針對性的治療方面的進(jìn)展將是有限的，并且治療將在很大程度上是經(jīng)驗(yàn)性的。生物標(biāo)記物的發(fā)展必須與治療一起加速。例如，(1)在顯微鏡觀察下使用激光恢復(fù)特定的細(xì)胞群。提取的蛋白質(zhì)用熒光染料標(biāo)記

8、，用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離。(三)通過散點(diǎn)圖評估2D-DIGE的再現(xiàn)性。3360將7個正常肝組織、11個鄰近的非腫瘤組織、6個高分化肝細(xì)胞癌和1個中分化HCC肝細(xì)胞癌歸為一組，而將13個中分化肝細(xì)胞癌和7個低分化肝細(xì)胞癌歸為一組。主成分分析也顯示了類似的結(jié)果(B)，在已鑒定的蛋白質(zhì)中，EB1由c-Myc、RhoA和CDC42控制，而在以前的報(bào)告中，EB1都與HCC惡性腫瘤相關(guān)，2。為了評價藥物的療效，大多數(shù)藥物和疾病的目標(biāo)是蛋白質(zhì)?？梢哉J(rèn)為，如果一種藥物能使疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)表現(xiàn)更接近正常狀態(tài)，該藥物的治療效果就更好。通過藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，研究藥物的毒理機(jī)制，

9、監(jiān)測藥物毒性的生物標(biāo)志物，可以準(zhǔn)確、快速地揭示藥物的毒副作用。檢測藥物刺激組織細(xì)胞的蛋白質(zhì)組，建立其蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，有助于了解其毒理機(jī)制，建立可用于評價其安全性的生物標(biāo)志物。例如，慶大霉素的明顯毒副作用是腎毒性。Kennedy等人用蛋白質(zhì)組學(xué)研究了用慶大霉素處理的大鼠血清樣品，發(fā)現(xiàn)了一種持續(xù)高表達(dá)的蛋白質(zhì)。該蛋白可能參與補(bǔ)體替代途徑的激活過程，并能與腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞結(jié)合，有望成為評價慶大霉素毒性的非侵入性標(biāo)志物。毒物與疾病登記署，2001，120 (1.3) :379-384。四.癌癥多藥耐藥性的蛋白質(zhì)組學(xué)研究：腫瘤細(xì)胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性后，也會對其他化療藥物產(chǎn)生不同程度的耐藥性，導(dǎo)致藥物

10、療效持續(xù)下降。多藥耐藥是化療成功的一個重要障礙，在癌細(xì)胞中發(fā)生的多藥耐藥通常是由于特定蛋白如細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)引起的，多種已發(fā)表的藥物蛋白質(zhì)組學(xué)研究提示了潛在的耐藥機(jī)制，(a)藥物測序，(b)PKC活性的調(diào)節(jié)，(c)細(xì)胞凋亡，和(d)米托蒽醌：米托蒽醌的調(diào)節(jié)；FABP :脂肪酸結(jié)合蛋白；硫氧還蛋白：-國內(nèi)生產(chǎn)總值離解抑制劑；膜聯(lián)蛋白：Map :微管相關(guān)蛋白(微管相關(guān)蛋白)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法在對不同抗癌藥物、抗癌藥物： a米托蒽醌、B柔紅霉素、c依托泊苷、d阿霉素、e紫杉醇、f順鉑、g文克里斯汀和h抗有絲分裂化合物有抗性的癌細(xì)胞系中鑒定的蛋白質(zhì)。根據(jù)蛋白質(zhì)組表達(dá)譜預(yù)測抗腫瘤藥物的化療敏感性

11、，化療是腫瘤的三種主要治療方法之一。近30年來，雖然一些惡性腫瘤的化療有了明顯的改善，但大多數(shù)腫瘤，尤其是實(shí)體瘤的療效仍不理想。這與腫瘤的個體差異和多重耐藥性有關(guān)。如何選擇有效的藥物并進(jìn)行個體化治療一直是化療的重點(diǎn)。傳統(tǒng)藥物敏感性試驗(yàn)方法及其存在的問題，藥物敏感性試驗(yàn)方法存在的問題，菌落形成法(HTCA)，標(biāo)本可評價率低，只有4070。實(shí)驗(yàn)周期長，檢測藥物需要2周以上，種類和數(shù)量有限，操作繁瑣，難以標(biāo)準(zhǔn)化，陽性預(yù)測值低，只有4060。四唑藍(lán)比色法靈敏度差，至少只能檢測500個細(xì)胞。范圍小，有效范圍在2.0以內(nèi)。細(xì)胞毒性差異染色(DiC)有多種適用的標(biāo)本類型。目前，它僅用于人類判斷血液腫瘤。難以推廣的樣品可評價率不高，僅有7080陽性預(yù)測值低，僅有7080，胸腺嘧啶核苷摻入法(3H-Td