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文檔簡介

1、微生物檢查體系的調(diào)整,微生物檢測環(huán)境變化,控制菌項(xiàng)目變化,非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計(jì)數(shù)法,通用要求要點(diǎn): (1) 微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。 本檢查法可采用替代檢查方法,包括自動(dòng)檢測法,但必須證明其替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。(9201)藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則 (2) 環(huán)境潔凈度應(yīng)符合要求。定期檢測:不低于B級的單向流空氣區(qū)域、工作臺面、環(huán)境。參考USP1117實(shí)驗(yàn)室分區(qū)原則。 (3) 前處理:供試品的抗菌活性,中和劑和滅活劑的有效性及無毒性。表面活性劑的無毒性及與相容性。 (4) 方法選擇:根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選

2、擇。(平皿法、薄膜過濾法和MPN法) (5) 菌種管理:(9203)藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則關(guān)于菌株管理的要求。 (6) 陰性對照:微生物檢查需進(jìn)行陰性對照試驗(yàn)。如果對照有菌生長,應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。,試驗(yàn)菌,微生物計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基,培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基適用性檢查,計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn),2、接種和稀釋,接種和稀釋,消除供試品的抑菌活性的方法 (1)增加稀釋劑和培養(yǎng)基的用量; (2)加入中和劑或滅活劑; (3)采用薄膜過濾法和沖洗; (4)綜合上述措施。 根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則,在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下,應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。若

3、方法適用性試驗(yàn)符合要求,應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進(jìn)行供試品檢測。,培養(yǎng)條件,結(jié)果判斷,供試品檢查部分 1、操作,供試品檢查部分 2、培養(yǎng),供試品檢查部分-結(jié)果判斷,供試品檢查部分-結(jié)果判斷,供試品檢查部分-計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn),非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:控制菌檢查法,通用要求要點(diǎn): (1)控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下,檢查供試品中是否存在特定的微生物。本檢查法可采用替代檢查方法,包括自動(dòng)檢測法,但必須證明其替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。(9201)藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則。 (2)供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求同非無菌產(chǎn)品微生物檢查:微生物計(jì)數(shù)法參考USP1117實(shí)驗(yàn)室分區(qū)

4、原則。 (3)前處理:供試品的抗菌活性,中和劑和滅活劑的有效性及無毒性。表面活性劑的無毒性及與相容性。 (4)在各控制菌項(xiàng)下:生化實(shí)驗(yàn)和“應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定實(shí)驗(yàn)?!备臑檩^少的生化實(shí)驗(yàn)或“采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定?!?控制菌結(jié)果判斷趨向多樣化, 控制菌檢查中將原來大腸菌群的檢測改為耐膽鹽的革蘭氏陰性菌,另外培養(yǎng)基體系也有較明顯的變化,較少的生化實(shí)驗(yàn)或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定(鏡檢、生化、色譜光譜技術(shù)、分子生物學(xué)等),供試品檢查部分-耐膽鹽革蘭陰性菌,大腸菌群的定義是指在37生長時(shí)能發(fā)酵乳糖,24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性、氧化酶陰性、需氧或兼性厭氧的無芽孢桿菌。它不是分類學(xué)上的名稱。符

5、合上述定義的菌除埃希菌屬外,還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬。,供試品檢查部分-耐膽鹽革蘭陰性菌,取供試品,用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計(jì)數(shù)法”(通則1105)制成1:10供試液,混勻,在2025 培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)使供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不繁殖(約2小時(shí))。 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定)腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中,3035 培養(yǎng)2448小時(shí)后,劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上,3035 培養(yǎng)1824小時(shí)。如果平板上無菌落生長,判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。 1:10TSB供試液(20-2

6、5 2h) 腸道增菌肉湯 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂 (大腸、銅綠+/金葡-) (大腸、銅綠+指示) 24-48h 18-24h,供試品檢查部分-耐膽鹽革蘭陰性菌,選擇和分離培養(yǎng) 取相當(dāng)于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和0.001ml)供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定)腸道增菌液體培養(yǎng)基中,3035培養(yǎng)2448h。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上,3035 培養(yǎng)1824h。 結(jié)果判斷 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長,則對應(yīng)培養(yǎng)管為陽性,否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果,從表二查對1g或1ml供試品中

7、含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。 表2 耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)(N) - 各供試品量的檢查結(jié)果 -每1g(或1ml)供試品種可能的菌數(shù)cfu 0.1g或0.1ml 0.01g或 0.001g或 - + + + N 103 + + - 102 N 103 + - - 10N102 - - - N 10 -,供試品檢查部分-大腸埃希菌,大腸埃希菌室腸桿菌科埃希菌屬的代表種 大腸埃希菌室兩端鈍圓的短小直桿菌,單個(gè)或成對,格蘭陰性。無芽孢,多鞭毛,培養(yǎng)最適溫度為37 ,可在1546 生長,兼性厭氧。 取1:10供試液至tsb(適宜體積)(18-24h) MaC肉湯 MaC瓊脂 (大腸+/金葡-)

8、(大腸+指示) 42-44 24-48h 18-72h 結(jié)果判斷 若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長,應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn),確證是否為大腸埃希菌;若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長,或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性,判供試品未檢出大腸埃希菌。,供試品檢查部分-沙門菌,沙門菌為革蘭陰性菌,無芽孢,菌體通常(0.40.9)um(13)um,兩端鈍圓。需氧或兼性厭氧,1042皆可生長,最適溫度37 . 加入10g供試品的TSB供試液(18-24h) RV肉湯 XLD瓊脂 (沙門+/金葡-) (沙門+/金葡-) 18-24h 18-48h 結(jié)果判斷 若木糖賴氨酸脫氧但酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有

9、疑似菌落生長,且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底面為黃色,或斜面黃色、底層黃色或黑色,應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn),確證是否為沙門菌。若果平板上沒有菌落生長,或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性,或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色;或斜面黃色、底層未見黃色黑色,判供試品未檢出沙門菌。,非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn),表1 非無菌化學(xué)藥品制劑、生物制品制劑、不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn),非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn),表2 非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn),非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn),表3 非無菌的藥用原料及輔料

10、微生物限度標(biāo)準(zhǔn)(新增) 表4 中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)(新增),非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn),限度標(biāo)準(zhǔn)由“數(shù)量”向“數(shù)量級”轉(zhuǎn)變 非無菌藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計(jì)數(shù)法”(通則1105)檢查;非無菌藥品的控制菌照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查:控制菌檢查法”(通則1106)檢查。各品種項(xiàng)下規(guī)定的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)解釋如下: 101 cfu: 可接受的最大菌數(shù)為20; 102 cfu: 可接受的最大菌數(shù)為200; 103 cfu: 可接受的最大菌數(shù)為2000:以此類推。 雖然擴(kuò)大了限度的標(biāo)準(zhǔn),但是對過程控制的要求有了很大的提高,培養(yǎng)基

11、的營養(yǎng)能力也有了很多的提高,未來將向參數(shù)放行方向發(fā)展。,1101 無菌檢查法-培養(yǎng)基,硫乙醇鹽酸流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng),也可用于需氧菌培養(yǎng);胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。,培養(yǎng)基體系與國際接軌,改變以往微生物分類培養(yǎng)的錯(cuò)誤,正確考慮培養(yǎng)基的廣譜性。否定了檢查中對微生物分類培養(yǎng)的概念,即某種污染了需氧菌的供試品,無論被接種在TSB中,均可被檢出,不容易漏檢。,1101 無菌檢查法-培養(yǎng)基的適用性檢查,本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。 1、無菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于五支(瓶),置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天,應(yīng)無菌生長。 2、靈敏度檢查-培養(yǎng)

12、基靈敏度檢查所用菌株傳代次數(shù)不得超過5代。,將枯草芽孢桿菌移到TSB靈敏度檢查中,能夠確保在兩種培養(yǎng)基中需氣菌都能夠生長,1101 無菌檢查法-培養(yǎng)基靈敏度檢查,12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支,分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支,另1支不接種作為空白對照,培養(yǎng)3天。 9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支,分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接種作為空白對照,培養(yǎng)5天。 對照管無菌生長,若加菌的培養(yǎng)基管生長良好,判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。,1101 無菌檢查法-方法適用性試驗(yàn),藥典規(guī)定 進(jìn)行產(chǎn)品無菌檢查時(shí),應(yīng)進(jìn)行方法

13、適用性檢驗(yàn),以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。 若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí),應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。,選用菌株的原則 代表性 普遍性 低或非致病性 標(biāo)準(zhǔn)菌株(或藥品中常見的污染菌) 試驗(yàn)方法:薄膜過濾法和直接接種法。可與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查,無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。 只要供試品允許,應(yīng)采用薄膜過濾法。 供試品檢查方法應(yīng)與方法適用性確認(rèn)的方法相同。 若是表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑,應(yīng)證明其有效性,且對微生物無毒性。 檢驗(yàn)數(shù)量及檢驗(yàn)量,表1、表2中最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽性對照試驗(yàn)的供試品用量,1101 無菌檢查

14、法-檢驗(yàn)量,表1:針對注冊性質(zhì) 表2、針對委托、進(jìn)口、國評等性質(zhì) 具體檢驗(yàn)量要看檢品的裝量來綜合三個(gè)表:如果是注冊的則看表1和表3,若果是其他的則看表2和表3 例1:注射用頭孢呋辛鈉,規(guī)格0.25g,注冊 查表1得 批產(chǎn)量:500,接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗(yàn)數(shù)量:2或20個(gè)(取較少者,目前我們都是取20個(gè))查表3得 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量:半量(即一瓶樣品可以對半接種至每種培養(yǎng)基) 綜上述得:取30瓶樣品,分三份接種至每種培養(yǎng)基里面。 例2:注射用宮縮素,規(guī)格10單位,注冊 查表1得 批產(chǎn)量:500,接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗(yàn)數(shù)量:2或20個(gè)(取較少者,目前我們都是取20個(gè))查表

15、3得 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量:全量 綜上述得:取60瓶樣品,分三份接種至每種培養(yǎng)基里面。 例3: 左卡尼汀注射液,規(guī)格5ml:1g左卡尼汀,進(jìn)口 查表2得 供試品最少檢查數(shù)量(瓶或支):10支 查表3得 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量:半量 綜上述得:取15支樣品,分三份接種至每種培養(yǎng)基里面。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查,陽性對照試驗(yàn) 無抑制作用的供試品以金色葡萄球菌為對照菌; 抗革蘭陽性為主的供試品,以金黃色葡萄球菌為對照菌; 抗革蘭陰性為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌; 抗氧菌的供試品,以生孢梭菌為對照菌; 抗真菌的供試品,以白色念珠菌為對照菌。 陰性對照試驗(yàn) 供試品無菌檢查時(shí),應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查-薄膜過濾法,操作方法:將規(guī)定量的供試品溶液按薄膜過濾法過濾,沖洗(按適應(yīng)性試驗(yàn)確認(rèn)的方法)。將培養(yǎng)基加至濾筒內(nèi) 檢查要點(diǎn):采用封閉式包,薄膜過濾器。濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45um。根據(jù)供試品特性選擇濾膜材質(zhì)。濾過過程保持液面覆蓋整張膜。每膜總沖洗量不得過1000ml。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查-培養(yǎng)及觀察,1101 無菌檢查法-結(jié)果判斷,陽性對照管應(yīng)生長良好,

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