《分子診斷》PCR.ppt

1、聚合酶鏈反應(yīng)及其應(yīng)用,檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 周 蘭 ,分子診斷學(xué),重醫(yī)醫(yī)學(xué)學(xué)士（1979年，臨床醫(yī)學(xué)） 重醫(yī)醫(yī)學(xué)碩士（1986年，病理生理學(xué)） 重醫(yī)醫(yī)學(xué)博士（1994年，臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)） 芝加哥大學(xué)博后（00-03年，分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室） 電子郵箱 ,檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 周 蘭,本講內(nèi)容,1 PCR概述 2 PCR原理 3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)與分析方法 4 PCR特點(diǎn)及應(yīng)用 5 PCR技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史 6 PCR衍生技術(shù) 7 熒光定量PCR 8 其它基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù) 9 PCR相關(guān)檢驗(yàn)的質(zhì)量管理,1-1 基因擴(kuò)增及其方式 gene amplification gene magnification,1 PCR（Polymer

2、ase chain reaction）概述,1-1 基因擴(kuò)增,1）定義：指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象 是基因表達(dá)增加的一種重要機(jī)制 一般說來 正常細(xì)胞中，特定基因的擴(kuò)增與其對(duì)內(nèi)外環(huán)境因素的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān) 病變細(xì)胞中，基因擴(kuò)增則是致病因素所致的異常擴(kuò)增,如腫瘤細(xì)胞中常見癌基因的擴(kuò)增 2）方式？,2） 基因擴(kuò)增的方式,（1）天然擴(kuò)增-機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增 在各種因素（發(fā)育和進(jìn)化的需要、對(duì)環(huán)境刺激的應(yīng)答等）作用下，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的復(fù)制擴(kuò)增 （2）人為擴(kuò)增 分子克隆-體外、細(xì)胞內(nèi) DNA合成儀-試管內(nèi)（無細(xì)胞體系） PCR-試管內(nèi)（無細(xì)胞體系）,重組DNA,目的基因,載體,復(fù)制子,宿主細(xì)胞,擴(kuò)增,擴(kuò)增,提取目

3、的DNA分子,1）基礎(chǔ)研究的需要 *醫(yī)學(xué)生命科學(xué)研究 *農(nóng)林畜牧魚業(yè)的基礎(chǔ)研究 2）應(yīng)用研究及應(yīng)用的需要 *醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（如基因診斷、法醫(yī)學(xué)檢測(cè)） *現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)（藥物開發(fā)，疫苗， 高質(zhì)量食品和日常生活用品等） ,1-2 PCR技術(shù)誕生所依賴的社會(huì)需求,1-3 PCR的定義,模板DNA 引物（引子序列，一對(duì)） 耐熱DNA聚合酶 四種單核苷酸 Mg 2+,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,

4、PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),第1輪結(jié)束,第2輪開始,一個(gè)分子DNA變成兩個(gè)分子,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn),第2輪結(jié)束,兩分子DNA變成4分子DNA,利用DNA聚合酶催化一對(duì)引物間的特定DNA片段在體外實(shí)現(xiàn)快速、大量擴(kuò)增的方法 也稱：無細(xì)胞克隆技術(shù) 或：特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法 是一種模擬體內(nèi)天然DNA復(fù)制過程的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新,1-3 PCR定義,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到分子生物學(xué)研究、臨床檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域

5、。 優(yōu)點(diǎn)： 特異、敏感、簡(jiǎn)便 自動(dòng)化 快速、高效（數(shù)小時(shí)內(nèi)可使模板擴(kuò)增107108倍）,2-1 DNA的變性和復(fù)性 2-2 PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系及反應(yīng)過程-三步曲 2-3 反應(yīng)的結(jié)果 2-4 PCR的反應(yīng)條件及其對(duì)PCR的影響 2-5 產(chǎn)物片段及其累積過程,2 PCR原理,2-1 DNA的變性與復(fù)性,DNA的變性（denaturation) 熱變性是實(shí)驗(yàn)室最常用的方法 DNA的復(fù)性（renaturation),1）標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系（五要素） （1）DNA模板(template)：靶基因 （2）原料：dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP） （3）催化酶：耐高溫的DNA聚合酶（如：Taq酶

6、） （4） 一對(duì)引物（primer）：擴(kuò)增序列的決定者 其與靶基因兩側(cè)序列互補(bǔ) （5） Mg2+ 和 Buffer,2-2 PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系及反應(yīng)過程,高溫變性：在高溫（95）下，待擴(kuò)增的靶DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板 低溫退火：在低溫（3755）下，兩條人工合成的寡核苷酸引物分別與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈 適溫延伸：在耐熱DNA聚合酶的最適溫度（72）下，以引物的3端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸為原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈,2） 反應(yīng)過程-三步曲,2）PCR的反應(yīng)過程,重復(fù)13步 2530輪,目的DNA片段 擴(kuò)增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈

7、 與引物復(fù)性,DNA變性 形成2條單鏈,子鏈延伸 DNA加倍,PCR原理示意圖,Sample denaturatation Primer annealing Primer extension,2-2 反應(yīng)過程,播放PCR短片,1）每一條雙鏈DNA模板，在一次熱循環(huán)后就成了 兩條雙鏈DNA分子 2）每次循環(huán)產(chǎn)生的DNA均能成為下次循環(huán)的模板 3）每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式（2n）迅速擴(kuò)增 4）經(jīng)過2530個(gè)循環(huán)后， 理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上 實(shí)際上一般可達(dá)106107倍（ why？）,2-3 PCR的結(jié)果,式中：Y 表示擴(kuò)增產(chǎn)物的量

8、 A 表示n-1次擴(kuò)增時(shí)DNA分子數(shù)量 E 表示擴(kuò)增效率 n 表示循環(huán)次數(shù) 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，即n=30時(shí) 若E=100%，則y=230=1073741824(109) 若E=80%，則y=1.830=45517159.6(107) 由此可見，其擴(kuò)增的倍數(shù)是巨大的!,PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)公式：Y=A（1+ E）n,2-3 PCR的結(jié)果 30次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle

9、 = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠（EB)等染色，在紫外燈照射下可見到DNA的特異擴(kuò)增區(qū)帶,是一種熒光染料，可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光 根據(jù)情況，可在凝膠電泳液中加入終濃度為 0.5ug/ml的EB；有時(shí)亦可在電泳后，將凝膠浸入該濃度的溶液中染色1015min EB染色后，肉眼可見核酸電泳帶的DNA量一般5ng 它是一種高誘變

10、性的化學(xué)物質(zhì) SYBR-green 和 gelred 是毒性更小的染料,溴化乙錠(ethidium bromide，EB),2-4 PCR的反應(yīng)條件及其對(duì)PCR的影響,PCR操作程序 向一微量離心管中依次加入雙蒸水、緩沖液、Mg2+、dNTPs、引物、DNA模板和Taq DNA聚合酶 混勻后，離心數(shù)秒，使反應(yīng)成分集于管底 加礦物油50100l于反應(yīng)液表面，防蒸發(fā) 置反應(yīng)管于PCR儀上，設(shè)置程序，進(jìn)行熱循環(huán),PCR反應(yīng)五要素 引物（primer） 酶（Taq DNA polymerase） dNTPs （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板（template） Mg2+ （magnes

11、ium）,1）模板：* 單、雙鏈均可 *幾乎不需要純化 *但，必須了解靶基因兩側(cè)的核酸序列 *一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞或裂解病原體，再消化除去染色體的蛋白質(zhì)以游離靶基因，便可直接用于PCR擴(kuò)增 * RNA模板提取時(shí)，要防止RNase降解RNA 注意：不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類, 微生物 細(xì)胞：血痕、精斑、口腔拭子、陰道拭子、尿樣、單根毛發(fā)、指甲削刮的碎屑、牙刷、琥珀中的昆蟲、木乃伊 固定和包埋的組織標(biāo)本：脫蠟、蛋白酶K消化 模板DNA的濃度： 0.12ug/100ul體系 *PCR產(chǎn)量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高 *但，模板DNA濃

12、度過高，則致非特異性產(chǎn)物增加,模板DNA的來源,2）耐熱的DNA聚合酶,來自嗜熱水生菌，耐熱 具有 5-3方向的聚合酶活性 5-3外切酶活性 逆轉(zhuǎn)錄酶活性 酶量增加：降低反應(yīng)的特異性 酶量過少：降低反應(yīng)的產(chǎn)量 來源： 有提純產(chǎn)物 也有基因工程產(chǎn)品,例：經(jīng)典的Taq DNA聚合酶的特性,該基因2496bp（832aa），酶蛋白為94KDa 酶催化反應(yīng)速度與溫度的關(guān)系 7580：延伸約150nt/酶分子/s 70: 延伸60nt/酶分子/s 55: 延伸24nt/酶分子/s 溫度過高(90以上) 過低(22以下),都降低Taq DNA酶活性,良好的熱穩(wěn)定性： PCR混合物中的Taq DNA聚合酶

13、92.5 X 130min 95 X 40min 97.5 X 56min 其熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應(yīng)的前提條件 也是PCR技術(shù)能迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的重要基礎(chǔ),仍可保持50%的活性,例：經(jīng)典的Taq DNA聚合酶的特性,忠實(shí)性 該酶無35外切活性 SO,在PCR反應(yīng)中如發(fā)生某些堿基的錯(cuò)配，該酶無法予以校正 即其保真性不如Pfu DNA聚合酶等 其堿基錯(cuò)配機(jī)率：2.110-4,例：經(jīng)典的Taq DNA聚合酶的特性,離子依賴性 Taq 酶依賴Mg2+，對(duì)Mg2+非常敏感 *以活性程度很低的鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.70.8mmol/L時(shí)，用不同濃度Mg2+進(jìn)行PCR反應(yīng)10mi

14、n，發(fā)現(xiàn)：MgCl2在2.0mmol/L時(shí)TaqDNA聚合酶的活性最高 *Mg2+過高：抑制酶活性 Mg2+在10mmol/L時(shí)可抑制4050%的酶活性,例：經(jīng)典的Taq DNA聚合酶的特性,TaqDNA聚合酶,具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈的3端加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3突出的單A核苷酸尾 另一方面，在僅有dTTP存在時(shí)，它可將平端的質(zhì)粒的3端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3端突出的單T核苷酸尾 應(yīng)用該特性，可實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法,除經(jīng)典的Taq酶外，還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)下列耐熱酶 1）Tth DNA聚合酶： *從Thermus thermophilus HB8中提取而

15、得 *該酶在高溫和MnCl2條件下，能有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA *當(dāng)再加入Mg 2+后，該酶的聚合活性大大增加 SO，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA與DNA的擴(kuò)增可用同一種酶催化 即該酶適用于RT-PCR,2）pfu DNA 聚合酶,是從Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5-3外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可校正PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，使產(chǎn)物的堿基錯(cuò)配率極低，催化DNA的忠實(shí)性比Taq DNA聚合酶 高12倍 PCR產(chǎn)物為平端（無3端突出的單A核苷酸）,3）Vent DNA聚合酶 *是從Litoralis棲熱球菌中分離出的 *不具有5-3外切酶活性，但具

16、有3-5外切酶活性，可以去除錯(cuò)配的堿基，具有校對(duì)功能 *可擴(kuò)增 12kb的模板DNA,對(duì)PCR所用的聚合酶的選擇原則和參考信息 （自學(xué)，了解）,TaKaRa PCR Enzymes,1.TaKaRa TaqTM 1） 用于12 kbp以下的DNA片段的PCR擴(kuò)增 2） 比較經(jīng)濟(jì)的PCR用DNA聚合酶 3） 適用于一般的PCR擴(kuò)增或檢測(cè) 2.TaKaRa Ex TaqTM 1） 用于15 kbp以下的DNA片段的PCR擴(kuò)增 2）融合了LA- PCR技術(shù) 3） 可信度是TaKaRa TaqTM 的34倍 4）從擴(kuò)增靈敏度、擴(kuò)增量、PCR條件的通用性考慮，是一種萬能型PCR用DNA 聚合酶,3.Ta

17、KaRa LA TaqTM 1）用于10 kbp以上的DNA片段的PCR擴(kuò)增 2） 融合了LA PCR技術(shù) 3） 可信度是TaKaRa TaqTM 的7倍 4） 適于擴(kuò)增富含GC或復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA（用GC Buffer） 4.PyrobestTM DNA Polymerase 1）高保真性（High Fidelity）：與Pfu、Vent DNA聚合酶相同，可信度是TaKaRa TaqTM的10倍以上 2）良好的擴(kuò)增性能：與TaKaRa TaqTM有相同的擴(kuò)增性能（優(yōu)于 Pfu、Vent DNA聚合酶）,TaKaRa PCR Enzymes,TaKaRa PCR Enzymes,5.TaK

18、aRa Z-TaqTM 1）反應(yīng)速度快，是TaKaRa TaqTM的5倍 2）擴(kuò)增性能良好，與TaKaRa Ex TaqTM 相同 3）可信度高，是TaKaRa TaqTM 的34倍,DNA Polymerase的可信度比較,TaKaRa PCR 酶的性能比較,PCR時(shí)酶的選用,引物：與靶基因兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸，其本質(zhì)是單鏈DNA，它決所得擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度 （1）引物長(zhǎng)度：18-40nt,常用20-24nt *至少18nt,這樣才能保證擴(kuò)增反應(yīng)的特異性 *太長(zhǎng)，則致退火時(shí)引物與模板結(jié)合不充分，擴(kuò)增產(chǎn)物減少,3）引物（primer)及其濃度,（2）引物跨度：以200-500bp為宜 特定條

19、件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段 （3）引物序列：除與靶序列兩側(cè)匹配外，還應(yīng)與核酸數(shù)據(jù)庫的其它序列不匹配(無明顯同源性） （4）引物濃度：一般是0.1-0.5 mol/L。理想狀態(tài)是-以最低引物量滿足對(duì)產(chǎn)物擴(kuò)增的最大需要 引物濃度偏高： 引起錯(cuò)配等，致反應(yīng)特異性下降 增加引物間二聚體的形成機(jī)會(huì)，降低擴(kuò)增效率,引物間互補(bǔ) 形成引物二聚體,引物內(nèi)互補(bǔ) 形成二級(jí)結(jié)構(gòu),引物設(shè)計(jì)的最大原則 在擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增效率上取得平衡 即最大限度地提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和效率 引物設(shè)計(jì)的軟件有很多 既可以在線設(shè)計(jì)，如Primer3 /cgi-bin/primer3/prime

20、r3_www.cgi 也可以用Primer5、Oligo6.65 等等,序列應(yīng)針對(duì)靶基因的高度保守區(qū)（最特異的區(qū)） 同時(shí)與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列（以減少非特異結(jié)合） 引物長(zhǎng)度以18-30nt為宜，多為20-24nt ATGC最好隨機(jī)分布（避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的 成串排列，尤其3-端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C） G+C占45-55% （G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶） 兩引物之間：匹配的GC含量（why? ）,引物設(shè)計(jì)原則（1）,引物設(shè)計(jì)原則（2）,引物內(nèi)部無互補(bǔ)序列，避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu) 兩引物間無互補(bǔ)序列，避免形成引物二聚體 引物3端為關(guān)鍵堿基,其第1和2個(gè)堿基要嚴(yán)格配對(duì)

21、，否則致PCR失敗或擴(kuò)增效率和特異性降低 5端無嚴(yán)格限制，其堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)，因此可在其外設(shè)計(jì)附加序列（見后,便于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和克隆)，其對(duì)PCR反應(yīng)無明顯影響,3,5,3,5,限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列 啟動(dòng)子序列 引入定點(diǎn)突變序列 探針標(biāo)記(讓引物中的核苷酸帶標(biāo)記）,4）dNTP的質(zhì)量與濃度,（1）dNTP呈顆粒狀：保存不當(dāng)易變性失活 （2）dNTP溶液呈酸性：先配成高濃度、小量分裝，-20凍存 （以1M NaOH或1M Tris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.07.5） 多次凍融會(huì)使dNTP降解 （3）濃度：取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度(920-200mol/L) 濃度過高

22、易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 （4）四種dNTP濃度應(yīng)相等 任何一種dNTP濃度不同于其它時(shí),容易引起錯(cuò)配,Mg2+是DNA聚合酶的激活劑 *0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系 *Mg2+過低和過高 Taq酶活性降低、特異性降低 PCR產(chǎn)物數(shù)量和質(zhì)量下降,5）Mg2+,6）循環(huán)參數(shù)（溫度、時(shí)間和次數(shù)）的設(shè)置, 變性溫度與時(shí)間 通常用9394 x l min 或95 x 20-30sec 若低于93，則需延長(zhǎng)時(shí)間 溫度不能過高，否則降低酶的活性 由于模板DNA鏈比較長(zhǎng)，因此PCR反應(yīng)的第一個(gè)循環(huán)的變性時(shí)間需要長(zhǎng)些 最后才是通過大量培養(yǎng)細(xì)菌來擴(kuò)增目的基因。要經(jīng)過DNA酶

23、切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等、提取和回收等程序,操作復(fù)雜，一般需要2-7天左右時(shí)間,4）對(duì)標(biāo)本的純度要求低：血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA 5）重復(fù)性好 6）用途廣泛 （1）醫(yī)學(xué) 基因組DNA分析，遺傳物質(zhì)的鑒定和遺傳病、 腫瘤和感染性疾病等的診斷、治療和預(yù)防 （2）農(nóng)林牧漁業(yè) （3）環(huán)境科學(xué) （4）法醫(yī)學(xué) （5）考古學(xué),PCR技術(shù)的應(yīng)用,該方法首先被應(yīng)用于人-珠蛋白DNA的擴(kuò)增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷 自1985年首次報(bào)道PCR方法以來，PCR被廣泛應(yīng)用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病、法醫(yī)鑒定和考古研究等多領(lǐng)域，并發(fā)揮著越來越大的作用

24、 九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面展開 1997年衛(wèi)生部下文禁止普通PCR在臨床診斷的應(yīng)用 1998年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開始在中國(guó)較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測(cè),PCR技術(shù)的應(yīng)用舉例,* DNA重組：目的基因獲得和篩選 * 基因檢測(cè) 1）病原生物基因檢測(cè)：感染性疾?。℉BV/HCV) 2）遺傳病的診斷：地中海貧血等 3）惡性腫瘤診斷：癌基因或抑癌基因突變、 耐藥基因表達(dá)水平、標(biāo)志物基因 4）性別基因鑒定 5）法醫(yī)學(xué)分析：個(gè)體識(shí)別、親緣鑒定,表 病原微生物檢測(cè)項(xiàng)目及方法,例如 癌基因或抑癌基因突變等 程序： PCR- 酶切-電泳 PCR-RFLP,正常,病人,PCR-RFLP,例如 基因鑒定,待測(cè)1

25、,待測(cè)2,Y引物,PCR 電泳,待2男性 待1女性,4 PCR特點(diǎn)及應(yīng)用,不足： 1）需靶DNA序列的信息 2）產(chǎn)物短小 3）錯(cuò)配,5 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史,核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明,胡德（LE Hood）實(shí)驗(yàn)室的4大發(fā)明（ABI）,蛋白質(zhì)測(cè)序儀:1977年（ABI) DNA合成儀：1982年（ABI) 1956年美國(guó)生物化學(xué)家科恩伯格與美國(guó)生化學(xué)家奧喬亞用人工合成的方法制得了DNA和RNA 1970年，印度血統(tǒng)的美籍學(xué)者科蘭納首次用化學(xué)方法人工合成了有77個(gè)核苷酸對(duì)的酵母丙氨酸的結(jié)構(gòu)基因 DNA測(cè)序儀：1986-06(ABI) 蛋白質(zhì)合成儀: 20世紀(jì)80年代（ABI) 1969年第

26、一臺(tái)自動(dòng)多肽合成儀問世 第一個(gè)產(chǎn)品是核糖核酸酶A(梅里菲爾德） 2003-05 第一臺(tái)中國(guó)自制多肽自動(dòng)合成儀投產(chǎn) (中國(guó)地奧基團(tuán)-胸腺五肽） ABI發(fā)明四大生物研究設(shè)備，并成功實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，為現(xiàn)在分子生物學(xué)的發(fā)展打下了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)，對(duì)世界生命科學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。胡德現(xiàn)任CNSI董事、美國(guó)納斯達(dá)克上市公司董事，他還是美國(guó)國(guó)家科學(xué)院(NAS)院士、美國(guó)學(xué)者協(xié)會(huì)會(huì)員、美國(guó)科學(xué)藝術(shù)學(xué)院院士,5 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史,核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明,由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困

27、難 這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視,1988年才木(Saiki) 等從嗜熱水生桿菌(Thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶，命名為Taq DNA聚合酶 其用于PCR時(shí)，在熱變性后不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶，大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，也增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度（2.0kb）,Thermus aquaticus,A hot spring in Yellowstone National Park,此菌于1969年由Brock分離自美國(guó)黃石公園溫泉，作為棲熱桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，其生長(zhǎng)溫度為7075。最初從中分離到分子量6068KDa，比活

28、性為20008000U/mg的DNA聚合酶 后來，Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬U/mg的純酶，分子量為93910。此種9.4KDa酶的最適溫度為7580，與單純核苷酸的結(jié)合率（Kcat）可達(dá)150核苷酸（nt）/s酶分子。以M13模板，用富含G+C的30bp引物延伸，70時(shí)Kact60nt/s；55可達(dá)24nt/s；37時(shí)為1.5nt/s，而22時(shí)低至0.25nt/s。高于90時(shí)DNA合成活性甚差，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結(jié)合,5 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史,核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明,Kary B. Mullis（1944）,PCR技術(shù)問世背后的故

29、事,在一個(gè)春天的夜晚,Mullis與女友駕車于美國(guó)加州西岸的128號(hào)公路途中有了PCR的靈感 Cetus公司以1萬$獎(jiǎng)勵(lì)他發(fā)展PCR，其后卻于1991年轉(zhuǎn)手將專利權(quán)以3億3千5百萬$轉(zhuǎn)賣給全球最大的制藥廠-瑞士offman-LaRoche公司，而使得PCR這個(gè)技術(shù)成為史上最貴的專利 瑞士這家公司現(xiàn)在正以連鎖反應(yīng)般的速率賺進(jìn)美金 此后，PCR的應(yīng)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表量令其他研究難望其項(xiàng)背 PCR對(duì)于基礎(chǔ)及臨床醫(yī)學(xué)的貢獻(xiàn)之深遠(yuǎn)，也難以估量,有時(shí)候一個(gè)創(chuàng)造性的靈感在你不經(jīng)意中突然浮現(xiàn)出來 在1983年4月的一個(gè)星期五的晚上 ，我和一個(gè)化學(xué)家朋友正在驅(qū)車去Mendocino縣的路上，她睡著了，美國(guó)10l國(guó)道也沒有駕車要求了。我喜歡晚上駕車，每個(gè)周末我都要去我北部的小木屋并在車上靜靜地呆上3個(gè)小時(shí)，來放縱我的思維。那個(gè)特殊的晚上我正在想著我計(jì)劃中的DNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)。車行