分子生物學與生物化學實驗操作設計與技能6-2

1、分子生物學與生物化學實驗操作、設計與技能,PCR技術的原理及應用（一） 李剛 副教授,contents,末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、電影侏羅紀公園，以及辛普森殺妻案，這四件事情到底有什么相關？,答案是沒有。只不過近十幾年來生物技術的一項新發(fā)明，把它們給連在一塊了。這項技術就是“聚合酶鏈反應”（polymerase chain reaction，PCR）。,Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應、分子克隆及DNA序列分析這三大類實驗方法幾乎構(gòu)成了現(xiàn)代分子生物學的實驗工作的基礎。而三者中，PCR方法在理論上出現(xiàn)最早，在實踐中應用得最廣泛。,國際象棋與

2、PCR,國際象棋的發(fā)明者，要了一個簡單的、天文數(shù)字的獎勵。這種獎勵方式在幾千年后引起了一個生物技術的革命。,PCR技術的故事,有時侯一個創(chuàng)造性的靈感在你不經(jīng)意中突然浮現(xiàn)出來。在1983年4月的一個星期五的晚上，通過一個令人難以置信的天真的甚至幸運的錯誤巧合，我獲得了一個重大的發(fā)現(xiàn)。那天晚上我正在緊握轎車的方向盤，在一條被月光籠罩的通向北加利福尼亞紅樹縣的山路上蜿蜒前行。這個重大發(fā)現(xiàn)就是我偶然想到的有關不受限制地制造大量的基因拷貝的過程，這個過程現(xiàn)在稱為聚合酶鏈式反應（PCR）。 K. B. Mullis The unusual origin of the polymerase chain re

3、action (SCI. Am. 262:56 1990),PCR 技術發(fā)展的歷史（1）,PCR技術起始于20世紀70年代早期,由Khorana與他的同事最先提出建議，作為一種降低化學合成基因工作量的策略。然而，在基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報道以及寡核苷酸引物合成尚處于手工及半自動合成階段，用聚合酶鏈式反應大量合成基因的想法似乎是不切合實際的。,PCR 技術發(fā)展的歷史（2）,15年后，Kary Mullis及他的Cetus公司的同時們，首次報道了用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段體外擴增哺乳動物單拷貝基因。雖然如此，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未發(fā)現(xiàn)之前， PCR可能還

4、是一種笨拙的中看不中用的實驗室方法。1988年，一種從嗜熱水生菌來源的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的應用，大大增加了PCR的效率，并且使PCR方法趨于自動化。,PCR 技術發(fā)展的歷史（3）,到20世紀80年末，克隆已不再是分離基因的唯一方法，DNA測序已取得了革命性的進展，PCR已經(jīng)成為遺傳與分子分析的根本基石。到今天，PCR方法已經(jīng)衍生出許許多多新的方法，成為一門專門的學科。由于發(fā)明了PCR技術，1993年，Mullis 獲得了諾貝爾化學獎！,PCR反應的七種基本成份,熱穩(wěn)定DNA聚合酶。 一對特異的引導DNA合成的寡核苷酸引物。 dNTP（混合液：標準PCR反應包含4種等摩爾濃度的脫氧核苷三磷酸，即

5、dATP、dTTP、dCTP和dGTP。 二價陽離子。所有的熱穩(wěn)定DNA聚合酶都要求有游離的二價陽離子，通常是Mg2+用于激活。 一價陽離子。標準PCR緩沖液內(nèi)包含有 50 mmol/L的KCl，它對于擴增大于500 bp的DNA片段是有益的，提高KCl濃度在約70100mmol/L范圍內(nèi)對改善擴增較短的DNA片段產(chǎn)物是有利的。 模板DNA。含有靶序列的模板DNA科研單鏈或雙鏈形式加入PCR混合液中。閉環(huán)DNA模板的擴增效率略低于線性DNA。盡管模板DNA的長短不是PCR擴增的關鍵因素，但當使用高分子量的DNA（10kb）作模板時，如用限制性內(nèi)切酶先行消化（此酶不應切割其中的靶序列），則擴增效

6、果更好。,聚合酶鏈式反應的過程,PCR是一種級聯(lián)反復循環(huán)的DNA合成反應過程。一般由三個步驟組成：模板的熱變性，寡核苷酸引物復性到單鏈靶序列上以及由熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化的復性引物引導的新生DNA鏈延伸聚合反應的過程。,PCR實驗的視頻,變性溫度的選擇,在應用Taq DNA聚合酶進行PCR反應時，變性往往是在94C95 C進行，這是Taq DNA聚合酶進行30個或30個以上PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失時所耐受的最高溫度。在PCR的第一個循環(huán)中，有時常把變性時間設計為5min，以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。但根據(jù)現(xiàn)在的經(jīng)驗，對于線性DNA分子而言，這種延長變性時間是沒有必要的，而且

7、在有些時候還是有害的。對于GC為55或更低些的線性DNA模板我們推薦常規(guī)的PCR的變性條件是94C95 C變性45s。 當模板DNA的GC%超過55時需要更高的變性溫度。來源于古細菌的DNA聚合酶比Taq DNA聚合酶更能耐受高溫，因此更適合用來擴增富含GC的DNA模板。,熔解溫度的計算,有幾個公式可用來計算寡核苷酸與其靶序列形成的雜合分子的熔解溫度。但沒有一個是盡善盡美的。最常用的兩個如下： 1、Wallace規(guī)則：是一個根據(jù)經(jīng)驗確定的簡便的計算公式，可用來計算長為1520個堿基的引物在高離子強度額溶液中（如1M NaCl）形成完全互補配對時的熔解溫度： Tm C 2 （AT）4（GC） 公

8、式中AT為核苷酸中A和T殘基的數(shù)目，GC為G和C殘基的數(shù)目。 2、Tm/ C=81.5 C+16.6(lg k+)+0.41%(G+C)-(675/n) 能夠合理預測一條長度為1470個核苷酸的引物在小于或等于0.4M的陽離子溶液中的熔解溫度。 在上述公式中，n是寡核苷酸引物的堿基數(shù)。該公式還可用來計算序列和大小都已知的擴增產(chǎn)物的熔解溫度。 現(xiàn)在很多引物設計軟件可幫助你精確計算出PCR引物的Tm值的大小。,復性溫度的選擇,復性（退火）采用的溫度至關重要。如果溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好地復性，擴增效率將會非常低。如果復性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復性，從而導致非特異性的DNA片段的擴

9、增。復性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度低35 C的條件下進行。目前沒有一個公式適用于所有長度和不同序列的寡核苷酸引物。最好通過對復性溫度比兩條寡核苷酸引物的熔解溫度低210 C范圍內(nèi)進行系列PCR預實驗來對復性條件進行優(yōu)化，或者可控制PCR儀在連續(xù)的循環(huán)中逐漸降低復性溫度來確定最佳復性溫度，即降落PCR（Touchdown PCR或梯度PCR）。降落PCR只需要一次PCR就可以對復性溫度進行優(yōu)化，因此常被用于常規(guī)PCR的擴增反應。,寡核苷酸引物的延伸,常在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化DNA合成的最適溫度下進行，對Taq DNA聚合酶來說最適溫度一般為72 C78 C。在最適溫度下，Taq

10、DNA聚合酶的聚合速率約為2kb/min，但作為一個由經(jīng)驗確定的規(guī)則，靶基因的每1000bp的擴增時間被設定為1min,依此類推。對于PCR的最后一個循環(huán)，許多研究者常把延伸時間增加為以前循環(huán)的延伸時間的3倍以上。從表面上看，這可以使所有的擴增產(chǎn)物完成延伸，但是根據(jù)現(xiàn)在的經(jīng)驗，PCR的結(jié)果并不因為延伸時間的延長而得到明顯的改觀。,循環(huán)數(shù)目,PCR擴增所需的循環(huán)數(shù)目取決于反應體系中起始模板的拷貝數(shù)以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應進入幾何級數(shù)增長期，反應會一直持續(xù)下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點上說，擴增產(chǎn)物中應該絕大多數(shù)是特異性的擴增產(chǎn)物。用Taq DNA聚合酶在一個含有105個

11、拷貝的靶序列的反應體系中進行30個循環(huán)后往往可以達到上述理想情況。以含有單拷貝的哺乳動物DNA為模板至少需要25個循環(huán)才能得到足夠量的擴增產(chǎn)物。一般PCR反應擴增的循環(huán)數(shù)在3035之間，偶爾會達到40個循環(huán)。,聚合酶鏈式反應中的可選成分,有研究表明，使用一些共溶劑和添加劑能夠降低高水平的錯誤引導與提高富含GC模板的擴增效率。共溶劑包括甲酰胺（1.25%-10% V/V）, 二甲基亞砜（DMSO，最高可達15 V/V）和甘油 （110 V/V）。添加劑包括氯化四甲銨，谷氨酸鉀（10200mM），硫酸銨，非離子的和陽離子的去垢劑和一些尚未被鑒定的“特異性的增強劑”，如Stratagene公司的Pe

12、rfect Match聚合酶增強劑和Clonetech公司的GCMelt。在高濃度時，許多添加劑和共溶劑都可以抑制PCR，對不同濃度的引物和模板DNA的組合都應該通過經(jīng)驗確定其最適濃度。 當PCR反應出現(xiàn)問題時，首先考慮的不是使用這些增強劑，而應該是對反應體系里的控制成分進行優(yōu)化，尤其是Mg2+和K+的濃度。這個普遍規(guī)律的一個例外是GCMelt的應用，它常常能夠克服和解決對富含GC的模板擴增時效率低下的問題。,抑制劑,PCR反應體系中任何成分的過量都可能成為抑制PCR反應的因素。常見的抑制劑有蛋白酶K，苯酚，EDTA。其他的一些物質(zhì)，如離子型去垢劑，肝素，精胺，血紅蛋白和上樣凝膠中的染料如溴酚

13、藍和二甲苯藍。 在許多情況下，引起擴增產(chǎn)率過低或者錯誤的擴增產(chǎn)物的主要原因是模板DNA中含有污染物，而模板DNA常常是惟一由研究者提供的反應成分。通過對模板DNA進行透析，乙醇沉淀，氯仿抽提，和或用樹脂進行層析等進化處理后即可解決PCR過程中遇到的許多問題。,PCR引物的設計（1）,1、堿基組成： GC含量應在40到60之間，4種堿基要在引物中分配均勻。 2、長度： 引物中與模板互補的區(qū)域應該1825個核苷酸長度。上下游引物的長度差別不能大于3bp。 3、重復和自身互補序列： 不能有大于3bp的重復序列或自身互補序列存在。這種序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，如果這種結(jié)構(gòu)在PCR條件下穩(wěn)定，它會非常有效地阻

14、止寡聚核苷酸和靶DNA之間的復性。 4、上下游引物的互補性： 一個引物的3端不允許結(jié)合到另一個引物的任何位點上。因為在PCR中引物的濃度往往是比較高，所以即使引物間微弱的互補，都會導致引物間形成雜交，隨后是引物二聚體的形成和擴增。如果引物二聚體在PCR早期形成，它將和DNA聚合酶、引物及核苷酸競爭進而抑制靶DNA的擴增。精心進行引物設計，應用熱啟動PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶（如： AmpliGold，PerkinElmer）都可以避免引物二聚體的形成。當在一個PCR中應用多對引物時，請注意檢查任何一個3末端都不能和其他任何引物互補。,PCR引物的設計（2）,5、解鏈溫度（Tm）：

15、計算出來的兩個引物的Tm值相差不能大于5 C。擴增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10 C。這些特性保證了擴增產(chǎn)物在每個PCR循環(huán)可有效地變性。 6、3末端： 3末端額性質(zhì)非常關鍵。如果可能的話，每個引物的3末端堿基應為G或C，不能為A。然而，并不推薦使用3端有NNCG或NNGC序列的引物，因為末端GC堿基高的自由能可以促進發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，還可能產(chǎn)生引物二聚體。 7、向引物的5端添加限制性酶切位點，噬菌體啟動子等序列：有用而又不與靶DNA序列互補的序列一般加到引物的5末端。一般來說，這些序列的存在不會顯著地影響寡核苷酸和靶DNA之間的復性。這些附加序列包括噬菌體啟動子和GC夾子。限制性酶

16、切位點是一個特殊情況。因為位于DNA分子5末端的限制性酶切位點的切割效率比較低，所以引物應當超出限制性內(nèi)切酶識別位點至少3個核苷酸。,PCR引物的設計（3）,8、引導位點的設置： 根據(jù)實驗的不同目的，引導位點的設置可能會受到突變位點、限制性內(nèi)切酶位點、編碼序列、微衛(wèi)星序列和順式作用元件的影響。當針對cDNA模板設計引物時，正向和反向引物最好結(jié)合到不同外顯子的不同區(qū)域。這些可以很容易地把來源于cDNA的擴增產(chǎn)物和來源于污染的基因組DNA的擴增產(chǎn)物區(qū)分開。 9、簡并PCR的引物： 當通過對純化的蛋白質(zhì)測定其一短段的氨基酸序列后， 對該氨基酸序列的包含所有可能的編碼組合的寡核苷酸簡并庫可用于擴增相應

17、的基因組或cDNA序列。,PCR引物的選擇,1、對靶基因中潛在的引物位點進行分析，這些位點應該不會形成同源多聚體結(jié)構(gòu)，也沒有明顯的形成二級結(jié)構(gòu)的趨勢，不會自身互補，與基因組中的其他序列無顯著的同源性。 2、 根據(jù)上述原則列出一系列可能的正向和反向引物。根據(jù)寡核苷酸引物與其靶序列形成雜合分子的熔解度的計算中提供的公司計算各引物的熔解溫度。 3、選擇一對匹配完好的正向和反向引物。兩條引物的GC含量相似，兩條引物的GC含量都應在4060之間。 4、對寡核苷酸的長度和或位置進行細調(diào)。使得引物的3末端核苷酸為G或C。檢查兩條寡核苷酸之間有無明顯的互補性。作為一條經(jīng)驗性的規(guī)律，一條引物上不應該含有三個連續(xù)

18、的與另一個引物互補的核苷酸。,計算機輔助寡核苷酸引物設計,1、DNASIS 2、DNA Manager 3、Primer Premier 5 (最好的引物設計軟件),PCR中的污染,PCR中較普遍遇到的問題是可被寡核苷酸引物擴增的外源DNA序列的污染問題。無論哪種情況，污染是由于操作者或他們的同事操作不干凈引起的，他們不經(jīng)意地把潛在的靶序列引物到PCR所用的設備、溶液或酶中。污染的一個標記是在缺少模板DNA的陰性對照中出現(xiàn)了擴增產(chǎn)物。這時，包含試驗DNA樣品的反應所獲得的擴增產(chǎn)物都是值得懷疑的。根據(jù)大多數(shù)人的經(jīng)驗，查找污染源往往所獲甚少。相反，扔掉所有的溶液、熔劑和一次性物品是一個較簡單、消費

19、低、也不繁瑣的方法。然后按照下面的步驟去降低將來實驗室中的污染可能性。 實驗室空間：理想條件下，PCR應該在一間單獨的實驗室內(nèi)進行，實驗室內(nèi)有整套的設備以及貯存緩沖液和酶的冰箱。然而對于大多數(shù)人來說較為實際的選擇是在實驗室中設置PCR劃出特定的區(qū)域。PCR的操作最好在配有紫外燈的超凈工作臺中進行。工作臺不用時燈應當是一直開著的。在工作臺中要放置微量離心管、一次性手套，其他必須品和一套專門用來加入PCR所用試劑的移液管。因為自動移液器的槍頭是最常見的污染源，所以應用一次性槍頭。另外，PCR儀英法放置在實驗室中一個單獨的區(qū)域，要和其他實驗操作臺完全分開。,最常見的PCR污染原因（1）,1、標本間交

20、叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。 2、PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染。,最常見的PCR污染原因（2）,3、PCR擴增產(chǎn)物污染。這是PCR反應中最主要最常見的污染問題.因為PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性

21、.還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣 槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.4、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見.因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡 便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。,防止污染的方法（1）,(一)合理分隔實驗室:將樣品的處理

22、、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定 等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應與其它步驟嚴格分開. 最好能劃分標本處理區(qū);PCR反應液制備區(qū);PCR循環(huán)擴增區(qū);PCR產(chǎn)物鑒定區(qū). 其實驗用品及吸樣槍應專用.實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA.(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題.由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。(三)預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液

23、應預先 配制好，然后小量分裝，-20保存.以減少重復加樣次數(shù)，避免污染機會.另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應放于同一冰盒或同一 冰箱.,防止污染的方法（2）,(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用.(五)設立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最低量的標準病 原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照 及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照.(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前

24、 應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。PCR檢測微量感染因子時，一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問題。,PCR操作人員規(guī)則（1）,為了預防污染的產(chǎn)生，進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。（一）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：1. 標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備；2. PCR擴增區(qū)，包括反應液的配制和PCR擴增；3. 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重

25、組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備PCR擴增產(chǎn)物分析產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。（二）分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：1 PCR用水應為高壓滅菌的雙蒸水；2 引物和dNTP用高壓滅菌的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制；3 引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。,PCR操作人員規(guī)則（2）,(三) 實驗操作注意事項：盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原

26、因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意：1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；3. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；5. 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；6. 操

27、作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；8. 重復實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。,污染源的尋找和追蹤,如果不慎發(fā)生污染情況，應從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。（一）設立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列

28、，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照，100個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預防措施比較嚴密，則考慮可能為環(huán)境污染。 環(huán)境污染中常見的污染源主要有：1. 模板提取時真空抽干裝置；2. 凝膠電泳加樣器；3. 電泳裝置；4. 紫外分析儀；5. 切膠用刀或手術刀片；6. 離心機；7. 冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等； 此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4）電泳檢測結(jié)果。8. 氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣