液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的原理與應(yīng)用 (2).ppt

1、質(zhì)譜法及其聯(lián)用技術(shù)的原理與應(yīng)用,解題,質(zhì)譜法（Mass Spectrometry, MS） 有機/無機/生物/同位素MS 質(zhì)譜儀可直接進(jìn)樣 常見儀器分析技術(shù) 液相色譜法（LC） 氣相色譜法（GC） 毛細(xì)管電泳法 感耦等離子體（ICP）原子發(fā)射光譜法 ,解題,為何要聯(lián)用？ 以LC-MS為例：LC的色譜分離MS的質(zhì)譜分 離（m/z分離） 兩個維度依次分離，是乘法，非加法！ 結(jié)合了LC和MS二者的優(yōu)點 辨證地看待“聯(lián)用” 儀器的小型化、微型化，如waters公司的Qda檢測器；ICP-MS。,Waters公司的液質(zhì)聯(lián)用儀,QqQ,QTOF,Sciex公司的質(zhì)譜儀,QTRAP,QTOF,QqQ,Orb

2、itrap,Thermo Fisher公司的液質(zhì)聯(lián)用儀,Agilent公司的質(zhì)譜聯(lián)用儀,ICP-QqQ質(zhì)譜儀,GC-QqQ質(zhì)譜儀,用途和優(yōu)點,以LC-QqQ-MS定性、定量最常用的多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式為例 靈敏度高 準(zhǔn)確地說信噪比高 LC：g/mL（ppm） LC-MS：ng/mL（ppb）、pg/mL（ppt） 特異性好 干擾小，定性準(zhǔn)確 降低了對樣品前處理的要求 是公認(rèn)的確證分析技術(shù)！,低分辨率質(zhì)譜儀,用途和優(yōu)點,以QTOF和Q-Orbitrap為代表： 質(zhì)量準(zhǔn)確度高（m/z精確到小數(shù)點后3-5位） 定性篩查的利器：半未知、全未

3、知化合物 如：北京CDC,高分辨率質(zhì)譜儀,從歷史談起,離子源和質(zhì)量分析器有多種不同的類型 以兩大主線介紹質(zhì)譜儀的發(fā)展史 進(jìn)樣系統(tǒng) 離子源（使分析物電離） 離子光學(xué)系統(tǒng) 質(zhì)量分析器（實現(xiàn)m/z分離，質(zhì)譜儀通常據(jù)其命名） 檢測器 真空系統(tǒng) 計算機系統(tǒng),質(zhì)譜發(fā)展史上的兩位先驅(qū),1897年，J. J. Thomson（湯姆孫，18561940）質(zhì)譜儀的雛形 1919年，F(xiàn). W. Aston（阿斯頓，18771945） 首次制成具有較高聚焦性能的質(zhì)譜儀，用其成功發(fā)現(xiàn)了多種同位素，獲1922年 的諾貝爾化學(xué)獎,質(zhì)量分析器發(fā)展史,1917年，Dempster 發(fā)明扇形磁場質(zhì)譜儀（扇形磁場分析器） 1934

4、年，Mattauch和Herzog 1953年，Johnson和Nier 分別設(shè)計出了兩種雙聚焦質(zhì)譜儀（扇形磁場分析器 扇形電場分析器） 1946年，Stephens 發(fā)明飛行時間（Time-of-Flight，TOF）質(zhì)譜儀 1949年，Hipple 發(fā)明離子回旋共振（Ion Cyclotron Resonance，ICR） 質(zhì)譜儀，是首個超高分辨率質(zhì)譜儀,質(zhì)量分析器發(fā)展史,1953年，W. Paul（保羅，19131993） 提出四極質(zhì)量分析器（Quadrupole Mass Analyzer，QMA）和四極離子阱（Quadrupole Ion Trap，QIT）的理論，隨后出現(xiàn)了四極質(zhì)譜

5、儀和QIT質(zhì)譜儀 H. G. Dehmelt（德梅爾特，1922） 對ICR質(zhì)譜儀的發(fā)展作出突出貢獻(xiàn) 與Paul共享了1989年諾貝爾物理獎的一半,質(zhì)量分析器發(fā)展史,1977年和1984年 兩種重要的串聯(lián)質(zhì)譜儀三重四極（Triple Quadrupole，QqQ）質(zhì)譜儀和QTOF質(zhì)譜儀誕生 1995年和1998年，Bier等和Hager 分別設(shè)計出了兩種線性離子阱（Linear Ion Trap，LIT） 1999年，A. Makarov（1966） 全新概念的分析器軌道阱（Orbitrap）,離子源發(fā)展史,氣體放電電離、火花電離、輝光放電電離、熱電離 最出現(xiàn)的電離技術(shù)，屬于無機電離技術(shù) 19

6、18年，A. J. Dempster 發(fā)明電子電離（Electron Ionization，EI） 最早的有機電離技術(shù)，至今仍廣泛使用 1954年，Inghram和Gomer 場電離，最早的“軟”電離技術(shù) 1966年，Munson和Field 發(fā)明化學(xué)電離（Chemical Ionization，CI）,離子源發(fā)展史,1969年，Beckey 場解吸，打開了MS用于生物大分子分析的大門 1980s，F(xiàn)enn（芬恩，19172010） 使電噴霧電離（Electrospray Ionization，ESI）取得重 大突破 1973年，Horning 大氣壓化學(xué)電離（Atmospheric Pres

7、sure Chemical Ionization，APCI） 1980年，Houk 以電感耦合等離子體（Inductively Coupled Plasma，ICP）為離子源，發(fā)明了ICP-MS，是元素分析的利器,離子源發(fā)展史,1987年，Tanaka（田中耕一，1959） 將基質(zhì)輔助激光解吸電離（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）用于蛋白質(zhì)分析； 因?qū)SI和MALDI引入生物大分子領(lǐng)域的卓越貢獻(xiàn)，Tanaka與ESI的發(fā)明者Fenn分享了2002年諾貝爾化學(xué)獎的一半,MS基本原理,MS是與光譜法、核磁共振波譜法并稱的三大物質(zhì)

8、定性手段之一 MS是通過形成氣相離子來研究物質(zhì)的一種方法，根據(jù)質(zhì)量、電荷、結(jié)構(gòu)和（或）理化性質(zhì)的差異，運用質(zhì)譜儀對離子進(jìn)行表征 提前是化合物能形成離子 m/z分離通過質(zhì)量分析器實現(xiàn)（電場；磁場；電場磁場）,關(guān)于m/z的理解,什么是“質(zhì)”？什么是“荷”？ 用于描述微觀離子質(zhì)量的單位 千克（Kg，SI單位，但單位太大） 道爾頓（Dalton，Da） John Dalton（17661844） 統(tǒng)一原子質(zhì)量單位（Unified Atomic Mass Unit，u） 1u1Da1.660 538 921（73）1027kg 注：原子質(zhì)量單位（Atomic Mass Unit，amu，已廢棄）,關(guān)于m

9、/z的理解,相對質(zhì)量VS絕對質(zhì)量 初中化學(xué)的重要概念“相對原子質(zhì)量（原子量）” 相對質(zhì)量單位為“1”，絕對質(zhì)量單位為u、Da等 相對質(zhì)量與以u為單位的絕對質(zhì)量在數(shù)值上相等 實際質(zhì)量VS平均質(zhì)量 要區(qū)分“元素”和“原子”的質(zhì)量。 例如，原子質(zhì)量是實際質(zhì)量，元素質(zhì)量是平均質(zhì)量（考慮了同位素豐度）。 原子量（是元素的質(zhì)量）原子質(zhì)量 分子量（是元素質(zhì)量的加和，MS中不能直接運用）,同位素分布,Sn的同位素分布,同位素分布,瘦肉精（C12H18Cl2N2O）的同位素分布,同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)：選擇占比較少的同位素組成形式,質(zhì)譜圖,質(zhì)譜圖（Mass Spectrum） 以離子的m/z為橫坐標(biāo)，質(zhì)量峰的強度為縱坐

10、標(biāo) 注意：質(zhì)譜圖并非指MS所得圖譜的總稱 橫坐標(biāo)既非保留時間，也非離子質(zhì)量,a、輪廓圖 b、棒圖,提取離子色譜圖,質(zhì)譜儀直接采集得到的是質(zhì)譜圖，經(jīng)計算機加工得到色譜圖 質(zhì)譜圖是色譜圖的基本組成單元,分辨率,分辨率（Resolution，R）反 映的是相鄰質(zhì)譜峰的分離程度 目前最常用的定義是“半峰 全寬（Full Width at Half Maximum，F(xiàn)WHM）定義”,分辨率,低分辨率：R1 000 中分辨率： R 1 00010 000 高分辨率： R 10 000100 000 超高分辨率： R 100 000 QMA是低分辨率，TOF和Orbitrap是（超）高分辨率 通常， QMA

11、的質(zhì)譜峰的半峰寬為0.7,質(zhì)量準(zhǔn)確度,準(zhǔn)確質(zhì)量（Accurate Mass）：實測值 精確質(zhì)量（Exact Mass）：理論值 質(zhì)量準(zhǔn)確度：二者的誤差 分辨率會影響質(zhì)量準(zhǔn)確度 QMA的質(zhì)量準(zhǔn)確度一般為0.1u,質(zhì)譜儀簡介,SCIEX的QqQ和QTRAPTM Thermo Fisher的Orbitrap SCIEX、Waters、Bruker的QTOF Bruker的FT-ICR,價格,GC-MS Q：80萬 QqQ：120萬 LC-MS QqQ：220330萬 QTOF：300400萬 Q-Orbitrap：400600萬 ICP-MS Q：100150萬 QqQ：200250萬,質(zhì)譜儀硬件組

12、成,進(jìn)樣系統(tǒng) 直接進(jìn)樣（如注射泵）、色譜儀等 離子源 離子光學(xué)系統(tǒng) 冷卻、聚焦、準(zhǔn)直等 質(zhì)量分析器,檢測器 電子倍增器、微通道板等 真空系統(tǒng) 為何需要保持真空？ 為何通常需要待機？ 需要液氮，是否矛盾？ 計算機系統(tǒng),離子源,離子源是使樣品分子、原子或自由基轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嚯x子的器件，是質(zhì)譜儀的“門戶” 有機MS中幾種常見的離子源 電子電離（Electron Ionization，EI）源 化學(xué)電離（CI）源 較“軟”電離；需要試劑氣；適合GC 大氣壓電離（Atmospheric Pressure Ionization，API）源 基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）源 適合蛋白質(zhì)分析 無機MS中幾種常

13、見的離子源 感耦等離子體（Inductively Coupled Plasma，ICP）源,EI源,曾稱為“電子轟擊（Electron Impact，EI）”電離源,特點,“硬”電離 分子離子、碎片離子； 多用于一級MS 質(zhì)譜圖重復(fù)性好,API源,顧名思義，API是在大氣壓而非高（如EI）或低（如CI）真空環(huán)境中實現(xiàn)的一類電離技術(shù) API源的出現(xiàn)，解決了色譜儀與質(zhì)譜儀接口的難題，極大地推動了LC-MS的成熟,API源,主要包括以下3種類型 電噴霧電離（Electrospray Ionization，ESI）源 大氣壓化學(xué)電離（Atmospheric Pressure Chemical Ioni

14、zation，APCI）源 大氣壓光電離（Atmospheric Pressure Photoionization， APPI）源,ESI源,SCIEX公司的ESI源,ESI源,Waters公司的ESI源（Z-Spray）,ESI源,Agilent公司的ESI源,ESI的機理,電離過程大致可分成三個階段（以ESI為例）： 第一階段：使溶液分散成帶電霧滴 強電場液滴形成泰勒錐瑞利穩(wěn)定極限錐噴流（Cone-Jet） 約1mm后就迅速膨脹為羽流（Plume），即多個帶正電荷的直徑為12m的霧滴（高壓靜電氣動輔助）,ESI的機理,錐噴流的照片,ESI的機理,第二階段是溶劑蒸發(fā)與霧滴-噴流分裂（Drop

15、let-Jet Fission） 溶劑蒸發(fā)霧滴縮小電荷密度增加當(dāng)達(dá)到瑞利穩(wěn)定極限時 遂發(fā)生“霧滴-噴流分裂” 循環(huán)往復(fù)體積越來越小,ESI的機理,第三階段是產(chǎn)生氣相離子，即離子從溶液中轉(zhuǎn)移出來以氣態(tài)存在 離子蒸發(fā)模型（Ion Evaporation Model，IEM） 當(dāng)霧滴半徑達(dá)nm級時，高揮發(fā)性的離子聚集在霧滴表面，在強電場作用下發(fā)生場輔助蒸發(fā)，直接從霧滴中“彈出”，成為氣相離子。 帶電殘渣模型（Charged Residue Model，CRM） 該模型認(rèn)為只有霧滴中的溶劑完全蒸發(fā)時，化合物才能繼承多電荷形成一個氣相離子。 兩種模型均有實驗支持。一般認(rèn)為，小分子化合物可用IEM解釋，大

16、分子化合物則用CRM解釋,ESI的特點,在大氣壓下進(jìn)行 對比：EI在真空狀態(tài)下進(jìn)行 “軟”電離 形成離子：加合離子MH、MNa、MNH4 、MCl等；去質(zhì)子化分子MH 對比：EI是“硬”電離 單電荷與多電離離子 小分子以單電荷離子為主，大分子以多電荷離子為主 基質(zhì)效應(yīng) 可能存在基質(zhì)增強或抑制 如何判斷是否存在？ 解決辦法？（同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)、基質(zhì)加標(biāo)、改進(jìn)樣品前處理）,質(zhì)量分析器,1. 四極質(zhì)量分析器（QMA） 定性、定量的利器；靈敏、特異，線性范圍寬 2. 四極離子阱（QIT） 捕獲離子；可實現(xiàn)多級質(zhì)譜法；定性能力強，定量能力不及QMA 3. 線性離子阱（LIT） 離子容量比QIT大，許多性能

17、優(yōu)于QIT ； 有2種類型，其中一種為QTRAPTM（Q-LIT） 注：以上3種質(zhì)量分析器有共同的理論基礎(chǔ)Mathieu（馬蒂厄）方程,質(zhì)量分析器,4. 飛行時間（TOF）質(zhì)量分析器 高分辨率（高質(zhì)量準(zhǔn)確度）；（半）未知物篩查 5. 軌道阱（Orbitrap） 超高分辨率（高質(zhì)量準(zhǔn)確度）；（半）未知物篩查 6. 扇形磁場分析器 7. 扇形電場分析器 不能單獨組成質(zhì)譜儀；與扇形磁場分析器組成雙聚焦分析器（最早出現(xiàn)的分析器之一，輝煌的時代已成過去時） 8. 離子回旋共振離子阱（ICR-IT） 超高分辨率（高質(zhì)量準(zhǔn)確度）；價格十分昂貴,四極質(zhì)量分析器,U是直流（DC）電壓 V是射頻（RF）電壓,理論

18、基礎(chǔ)Mathieu方程,由法國數(shù)學(xué)家. Mathieu（馬蒂厄，18351890）于1868年提出，最初是為了解決橢圓形鼓膜的橫向振動一類的問題，后來發(fā)現(xiàn)可用來描述離子在四極場中的運動軌跡及穩(wěn)定運動的條件,運動方程,Orbitrap（軌道阱）,TOF,串聯(lián)質(zhì)譜儀和多級質(zhì)譜儀,由兩個及以上的質(zhì)量分析器串聯(lián)組成 碰撞池是連接各質(zhì)量分析器的橋梁 單一型 QqQ、QqQqQ、TOF-TOF 雜交型 Q-LIT、QTOF、Q-Orbitrap、LIT-Orbitrap、QIT-TOF,QqQ和Q-LIT質(zhì)譜儀,QqQ（ QoQ、 QhQ ） h表示六極桿（Hexapole）、o表示八極桿（Octopol

19、e） 碰撞池 僅加RF電壓；小寫q以示區(qū)別 碰撞氣（以N2居多）,QqQ和Q-LIT質(zhì)譜儀,QTRAP系列,串聯(lián)質(zhì)譜法和多級質(zhì)譜法,串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MS，MS2）和多級質(zhì)譜法（MSn） 先驅(qū)離子（母離子、前體離子）和產(chǎn)物離子（子離子、孫離子、第n代產(chǎn)物離子）是相對而言的 m1m2m3m4m5 空間MS/MS和MSn 在串聯(lián)質(zhì)譜儀和多級質(zhì)譜儀上實現(xiàn) 時間MS/MS和MSn 通過不斷增加分析器個數(shù)來增加MS的級數(shù)畢竟是不現(xiàn)實的 不需要串聯(lián)質(zhì)譜儀和多級質(zhì)譜儀 QIT、LIT和ICR等離子阱類質(zhì)譜儀,單級MS掃描模式,以四極質(zhì)譜儀為例： Q1全掃描（ Q1 Full Scan） Q1選擇一段m/z范

20、圍的離子通過，q2、Q3全通過 用于需找未知化合物；目標(biāo)化合物的方法開發(fā) Q3全掃描（ Q3 Full Scan） Q1、q2全通過，Q3選擇一段m/z范圍的離子通過,單級MS掃描模式,選擇離子監(jiān)測（Selected Ion Monitoring，SIM） Q1選擇一個特定m/z的離子通過，q2、Q3全通過 或者， Q1、q2全通過，Q3選擇一個特定m/z的離子通過 目標(biāo)化合物的定性、定量分析 信噪比比全掃描更高 GC-MS最常用的掃描模式,MS/MS掃描模式,多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM） 又稱為“選擇反應(yīng)監(jiān)測（Selected Reaction Monitoring，SRM）” “反應(yīng)”指的是碰撞反應(yīng) MRM是QqQ最主要的工作模式，用于定量分析,MS/MS掃描模式,MRM模式下，每一化合物選擇2組離子對即可確證 Commission Decision of 12 August 2002: Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results (2002/657/EC). Off J Eu