腫瘤壞死因子（精品課件）

1、1,腫瘤壞死因子,2,近年來，人們一直都在尋找攻克惡性腫瘤的方法，但到目前為止仍然沒有十分有效的治療手段。所以,尋找具有生物活性的細胞毒性分子誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡逐漸成為腫瘤生物治療領(lǐng)域關(guān)注的焦點。 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是迄今發(fā)現(xiàn)的直接殺傷惡性腫瘤作用最強的生物活性因子，能特異性殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯的毒性作用，因而受到人們的普遍重視。,3,目前普遍認為，TNF最早是1975年由Carswell發(fā)現(xiàn)的。Carswell在研究中觀察到，經(jīng)卡介苗致敏的小鼠被注射大腸桿菌內(nèi)毒素后，血清中出現(xiàn)一種物質(zhì)，該物質(zhì)在體內(nèi)可以使移植腫瘤發(fā)生出血、壞死，遂將該物

2、質(zhì)命名為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF),4,自Carswell發(fā)現(xiàn)TNF后，許多學(xué)者進行的其他研究均觀察到TNF在體外和體內(nèi)對多種腫瘤細胞有明顯的細胞毒作用。1984年P(guān)ennica等首次克隆了人TNF-的cDNA，并在大腸桿菌中表達成功。 20世紀80年代末，西方國家就已批準了人TNF治療惡性腫瘤的臨床試驗，但因毒副作用太強而未能進行下去。,5,隨著對TNF結(jié)構(gòu)和作用機制的深入研究，一些高效、低毒的TNF變構(gòu)體不斷涌現(xiàn)，TNF的臨床研究又有了新的進展。下面簡單介紹一下TNF。 TNF的結(jié)構(gòu)與功能 TNF的生物學(xué)活性 TNF抗腫瘤作用的機制 TNF的基因療

3、法,6,TNF的結(jié)構(gòu)與功能,把巨噬細胞產(chǎn)生的tnf命名為tnf- ，把t淋巴細胞產(chǎn)生的淋巴毒（lymphotoxin,lt)命名為tnf-。tnf-又稱惡質(zhì)素。,7,tnf-是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，lps是較強的刺激劑。ifn-、m-csf、gm-csf對單核細胞/巨噬細胞產(chǎn)生tnf-有刺激作用，而pge則有抑制作用。前單核細胞系u937、前髓細胞系hl-60在pma刺激下可產(chǎn)生較高水平的tnf-。t淋巴細胞、t細胞雜交瘤、t淋巴樣細胞系以nk細胞等在pma刺激下也可分泌tnf-。sac、pma、抗igm可刺激正常b細胞產(chǎn)生tnf-。此外，中性粒細胞、lak、星狀細胞、內(nèi)

4、皮細胞、平滑肌細胞亦可產(chǎn)生tnf-。,8,tnf-是一種淋巴因子，抗原和絲裂原均可刺激t淋巴細胞分泌tnf-。pma刺激rpmi1788b淋巴母細胞可分泌高水平tnf-。,9,人的tnf-基因長約2.76kb，小鼠為2.78kb，結(jié)構(gòu)非常相似，均由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，與mhc基因群密切連鎖，分別定位于第6對和第17對染色體上。 人 和小鼠tnf-基因分別定位于第6和第17號染色體。hutnf-分子由205個氨基酸殘基組成，含34氨基酸殘基的信號肽，成熟型hu tnf-分子為171個氨基酸殘基，分子量25kda。,10,腫瘤壞死因子的作用,借助機體免疫功能，對同一腫瘤產(chǎn)生直接和間接雙重活

5、性的抗癌效應(yīng)，并使?fàn)I養(yǎng)血管出血壞死。 刺激成纖維細胞(修復(fù) )增殖。 抑制脂蛋白的脂質(zhì)活性。 增進凝血因子及組織因子(血液凝固 )的活性。,11,誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2(白介素2，參與抗腫瘤效應(yīng))及IL-6 增強中性粒細胞(趨化、吞噬和殺菌 )對血管內(nèi)皮的黏附性。 產(chǎn)生菌溶刺激因子等。 在體外對人類腫瘤細胞(如鼻咽癌、子宮癌、白血病等)有直接抑制增殖作用。在體內(nèi)可引起腫瘤壞死、瘤體縮小以致消失。,12,TNF的生物學(xué)活性,TNF是一種真正的多效因子，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。它可直接作用于T細胞、B細胞、NK細胞等效應(yīng)細胞， 在細胞水平上發(fā)揮作用。 與受體結(jié)合，引起細胞破壞、死亡 損傷內(nèi)皮細胞，激活凝血系

6、統(tǒng) 引起機體發(fā)熱 促進細胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)機體免疫功能 抑制新骨生成、刺激骨吸收 激活嗜中性粒細胞和巨噬細胞,13,TNF抗腫瘤作用的機制,通過TNF受體介導(dǎo)的對腫瘤細胞的直接殺傷作用 抑制細胞生長和誘導(dǎo)凋亡 通過損傷腫瘤的血供系統(tǒng)而導(dǎo)致腫瘤的壞死 通過引起腫瘤局部的炎癥反應(yīng)和機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用 逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥，增加對化療藥物的敏感性,14,TNF的基因療法,TNF基因?qū)朊庖呒毎栽鰪娖涿庖邭?yīng) 1993年首次將TNF基因?qū)隩 細胞，與未轉(zhuǎn)染的T 細胞比較，轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生大量TNF，但與相同條件下轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞相比產(chǎn)量很低。隨后，Tashiro等將TNF基因?qū)隠AK

7、細胞，使LAK細胞膜表面TNF呈陽性，分泌量增加，細胞毒活性增強。,15,將TNF基因?qū)肽[瘤細胞以誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答 有實驗證實局部的TNF高濃度可在宿主沒有毒性反應(yīng)的情況下導(dǎo)致腫瘤消退。1992年Rosenberg等用TNF基因轉(zhuǎn)染自身腫瘤細胞，然后收集引流部位的淋巴細胞，經(jīng)體外加IL-2培養(yǎng)擴增后回輸給病人。期望通過遺傳工程技術(shù)使腫瘤細胞額外產(chǎn)生TNF，刺激局部的淋巴細胞和趨化全身其它部位的淋巴細胞到達腫瘤部位，增強免疫殺傷作用，但臨床效果不佳。,16,TNF突變型,由于多數(shù)學(xué)者認為TNF的細胞毒活性是由TNFR-p55介導(dǎo)的，因此研究者們主要致力于改建能選擇性地與TN

8、FR-p55結(jié)合的TNF突變型。 已報道有些TNF突變型能選擇性地結(jié)合TNFR-p55,而與TNFR-p75的親合力很低。人們希望這些TNF突變型用于臨床治療時能突出其抗瘤效應(yīng)，而同時盡可能地降低其毒副作用。,17,受體選擇性TNF突變型 TNF的生物學(xué)活性是通過TNFR介導(dǎo)的。當(dāng)TNF與TNFR結(jié)合后即內(nèi)化并降解，產(chǎn)生一系列細胞內(nèi)信號，導(dǎo)致不同的生物學(xué)活性。雖然目前對兩類TNFR是否有分工及如何分工尚無一致意見，但二者細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)差別很大，幾乎可以肯定它們在細胞內(nèi)信號 傳遞上存在差異。由于多數(shù)學(xué)者認為TNF的細胞毒活性是由TNFR-p55介導(dǎo)的，因此研究者們主要致力于改建能選擇性地與TNFR-

9、p55結(jié)合的TNF突變型。已報道有些TNF突變型能選擇性地結(jié)合TNFR-p55,而與TNFR-p75的親合力很低。人們希望這些TNF突變型用于臨床治療時能突出其抗瘤效應(yīng)，而同盡可能地降低其毒副作用。,18,不分泌性 TNF突變型,Kriegle等首先發(fā)現(xiàn)，人T N F-a有兩種形式，即26k D膜結(jié)合型及17kD分泌型。認為這兩種形式的人T N F-a均有細胞毒活性。此后，另一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合型TNF在殺傷TNF敏感的靶細胞中起主要作用。1990年，Perze等通過缺失突變?nèi)薚 N F-a得到一個僅表達在細胞膜表面、不分泌的TNF突變型。他們用這種不分泌的 TNF突變型基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞

10、發(fā)現(xiàn)，這種不分泌的TNF突變型能殺傷腫瘤細胞及 病毒感染細胞，且能將其作用局限在靶細胞附近而不引起TNF分泌所導(dǎo)致的全身性毒副作用。因此人們設(shè)想，如果將這種TNF突變型用于基因治療，既可增強抗瘤效應(yīng)，又可以克服TNF分泌量過高引起的毒副作用，有可能解決野生型TNF基因用于基因治療中所存在的一些問題。,19,TRAIL及其受體,腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)或稱凋亡素2配體(Apo2 ligand,Apo-2L), 是近幾年發(fā)現(xiàn)的一個可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的TNF家族成員。,20,TRAIL最大的優(yōu)點是它可以

11、選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,但對正常細胞沒有毒副作用。因此,TRAIL已經(jīng)成為許多研究的熱點,并有可能成為新一代的抗腫瘤藥物。,21,TRAIL的結(jié)構(gòu)特點,人TRAIL分子屬型跨膜蛋白,包括胞漿區(qū)(14aa)、跨膜區(qū)(26aa)和胞膜外區(qū)(241aa)。C端(細胞外區(qū)域)保守性強,能形成幾個折疊,再形成典型的夾心結(jié)構(gòu),進而形成同源三聚體的亞結(jié)構(gòu);N端(細胞內(nèi)區(qū)域)沒有信號肽序列,其發(fā)揮功能的部位主要位于胞外區(qū)。,22,TRAIL受體,TRAIL是通過與其細胞膜受體結(jié)合發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用的,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種TRAIL受體,它們都可以與TRAIL發(fā)生特異性結(jié)合,并且不與其它細胞毒配體結(jié)合。,23,死亡

12、受體,TRAIL-R1和TRAIL-R2均屬于TNFR(TNFreceptor)基因超家族成員。它們分別具有一段死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,簡稱DD),與TRAIL結(jié)合后可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,故又被稱作死亡受體。TRAIL-R1也稱死亡受體4(death receptor-4,DR4), DR4屬型跨膜蛋白，它的胞外區(qū)有兩個半胱氨酸富集區(qū)(cysteine-rich domain, CRD),胞內(nèi)有一段由70個氨基酸組成的死亡結(jié)構(gòu)域。,24,TRAIL-R2也稱死亡受體5(DR5), DR5也屬型跨膜蛋白, 它的胞外和胞內(nèi)區(qū)也分別含有兩個半胱氨酸富集區(qū)及一段死亡結(jié)構(gòu)域。 DR5過表達可

13、引起多種細胞發(fā)生凋亡,例如: Jurkat為TRAIL敏感細胞株,細胞表面DR5高水平表達,當(dāng)用DR5的單克隆抗體(DR5mAb)與Jurkat細胞表面的DR5作用后,TRAIL對Jurkat細胞的殺傷功能幾乎完全被阻斷。,25,誘騙受體,TRAIL-R3和TRAIL-R4因為沒有死亡結(jié)構(gòu)域,或死亡結(jié)構(gòu)域不完整,雖然可以與TRAIL結(jié)合,但不能傳遞死亡信號,無法誘導(dǎo)細胞凋亡,故被稱為誘騙受體。這類受體可能在正常細胞抵制TRAIL的誘導(dǎo)凋亡作用中扮演重要角色。,26,TRAIL-R3也稱誘騙受體-1 ( decoy receptor-1,DcR1)它是一個糖基磷脂酰肌醇(glycophos-ph

14、atidyl inosito,l GPI)錨定的細胞表面蛋白。DcR1與TRAIL親和力較高,它有5個糖基化位點,去糖基化可以增強DcR1與TRAIL的親和力。它在胞外區(qū)含有一段與死亡受體同源性很高的半胱氨酸富集區(qū),不同點在于它沒有胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域,因此可以與TRAIL結(jié)合但不能傳遞死亡信號。,27,TRAIL-R4也稱DcR2,它是一個由386氨基酸編碼的型跨膜蛋白, 與死亡受體相比,DcR2的C端缺少52個氨基酸,即胞內(nèi)有一段不完整的死亡結(jié)構(gòu)域,故也不能傳遞死亡信號。,28,TRAIL的作用機制,TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡主要有兩個途徑: (1)半胱天冬酶(cas

15、pase)和死亡受體相關(guān)的細胞凋亡途徑; (2)線粒體相關(guān)的細胞凋亡信號途徑。TRAIL與其他TNF家族成員一樣,可以誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡,而且對抑癌基因p53突變造成的對放療、化療不敏感的腫瘤細胞也有較好的誘導(dǎo)凋亡的作用。,29,半胱天冬酶(caspase)和死亡受體相關(guān)的細胞凋亡途徑,TRAIL三聚體能誘發(fā)死亡受體DR4和DR5三聚體化。死亡受體一端通過胞外區(qū)的半胱氨酸富集區(qū)與TRAIL結(jié)合并被活化,另一端通過胞內(nèi)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白(adaptor pro-tein)C端的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合,接頭蛋白再以其N端死亡效應(yīng)域(DED)與半胱天冬蛋白酶原(pro-caspase)在末端的局部募

16、集并串連結(jié)合,形成TRAIL-死亡受體-接頭蛋白-pro-caspase死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(DISC),30,促使pro-caspase自身水解成為有活性的caspase-8。 Caspase-8可以激活caspase級聯(lián)反應(yīng),進一步募集和激活caspase家族中的下游信號傳導(dǎo)酶,直至最終激活效應(yīng)酶caspase-3,誘導(dǎo)細胞凋亡。,31,線粒體相關(guān)的細胞凋亡信號途徑,在線粒體途徑中, caspase-8被激活后通過線粒體釋放細胞色素C(Cytochrome C)來激活caspase-3誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。具體途徑是: DISC激活caspase-8后, caspase-8催化Bcl-2家族蛋白

17、Bid(Bcl-2 inhibi-tory BH3-domain)降解生成截短的Bid( tBid), tBid導(dǎo)致線粒體釋放Cytochrome C與Apaf-1(Apoptosis protease-activator factor-1)和dATP共同促使procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9,進而活化效應(yīng)蛋白caspase-3,最終導(dǎo)致細胞凋亡。,32,此外，死亡受體與配體結(jié)合后，促使磷脂酶C水解卵磷脂生成甘油二脂，甘油二脂使蛋白激酶C-6活化，蛋白激酶C-6能夠使磷脂爬行酶-3（Phospholipid scramblases 3 PLS 3 ）磷酸化，之后促進

18、線粒體膜上磷脂的雙向運動，與Bid(Bcl-2家族蛋白)相互作用，導(dǎo)致細胞色素C的釋放，促使procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9,進而活化效應(yīng)蛋caspase-3,最終導(dǎo)致細胞凋亡。,33,線粒體相關(guān)的細胞凋亡信號途徑,半胱天冬酶(caspase)相關(guān)的細胞凋亡途徑,34,正常細胞或腫瘤細胞抗TRAIL誘導(dǎo)凋亡的機制,TRAIL最大的優(yōu)點是它可以選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,但對正常細胞沒有毒副作用。雖然DR4和DR5在腫瘤細胞和正常細胞中的表達水平相當(dāng),但兩種細胞對TRAIL的敏感性確相差甚遠,這就不能合理解釋正常細胞存在TRAIL抗性的原因,直至人們發(fā)現(xiàn)了TRAIL的誘

19、騙受體才解釋了其中部分原因。,35,DcR1和DcR2廣泛的表達于人體各正常組織,但在變異細胞中低表達甚至不表達,它們與死亡受體競爭性結(jié)合TRAIL,由于沒有死亡結(jié)構(gòu)域或死亡結(jié)構(gòu)域不完全,胞外區(qū)雖然可以同TRAIL特異性結(jié)合,但胞內(nèi)區(qū)不能通過DD同接頭蛋白結(jié)合激活caspase-8,不能通過caspase的級聯(lián)效應(yīng)激活效應(yīng)蛋白caspase-3,最終無法誘導(dǎo)細胞凋亡。腫瘤細胞由于缺乏誘騙受體的保護而易被TRAIL殺傷。,36,近年來許多研究顯示,除了誘騙受體對細胞的保護作用外,TRAIL還能通過激活A(yù)kt途徑核因子B(NFB)、蛋白激酶C(PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員等多

20、種機制調(diào)節(jié)TRAIL的凋亡誘導(dǎo)活性。此外,死亡受體核苷酸的突變和OPG的競爭性作用也可能造成細胞對TRAIL的抗性。,37,TRAIL在腫瘤治療中的應(yīng)用,TRAIL因其對正常細胞沒有毒副作用的優(yōu)點，現(xiàn)已成為腫瘤治療研究領(lǐng)域研究的熱點。TRAIL可以誘導(dǎo)近2/3的腫瘤細胞系發(fā)生凋亡，對乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、腎臟腫瘤和白血病細胞等均有抑制細胞生長和細胞毒效應(yīng)。,38,雖然TRAIL可以誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡，是一種較有前途的抗腫瘤藥物，但是，仍存在一些對TRAIL敏感性低的腫瘤細胞,在一定程度上限制了它的應(yīng)用。 近年來,人們在TRAIL與離子射線、抗真菌藥、化療藥、基因毒性藥和細胞因子的聯(lián)合治療方面

21、做了大量研究，并取得了比較滿意的結(jié)果，使TRAIL在抗癌領(lǐng)域更加有效的發(fā)揮功能。研究發(fā)現(xiàn)，重組TRAIL與化療藥物順鉑共同使用時，二者的協(xié)同作用對卵巢癌細胞的誘導(dǎo)凋亡作用明顯強于兩者單獨使用。,39,雖然人們通過大量的研究已經(jīng)對TRAIL有了比較深入的了解，但具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制、基因調(diào)控、在健康或病體體內(nèi)的確切作用等許多方面仍不十分清楚。隨著對這種活性大分子的研究繼續(xù)深入, TRAIL可能將是一種具有廣闊臨床應(yīng)用前景的抗癌藥物。,40,腫瘤壞死因子與疾病,應(yīng)用TNF在治療腫瘤等方面開始臨床期試驗，也可與IL-2治療腫瘤，目前認為全身用藥的療效不及局部用藥，后者如病灶內(nèi)注射，局部濃度高且副作用也

22、較輕。近年來已采用TNF基因治療開始對黑素瘤等腫瘤進行臨床驗證。值得重視的是TNF又與臨床某些疾病的發(fā)生有關(guān)。 近來一些研究證實在動物實驗中一些胰腺外或其他器官(如肺臟)的炎癥及組織破壞的發(fā)展往往需要某些細胞因子受體的激活，表明這些細胞因子可能參與了胰腺炎多器官功能衰竭的發(fā)生發(fā)展。例如：腫瘤壞死因子(TNF-)與急性胰腺炎及多器官功能衰竭的關(guān)系,41,例如：,動物在注入TNF-后能復(fù)制出類似內(nèi)毒素休克時出現(xiàn)的高熱、心動過速、低血壓和基礎(chǔ)代謝率增高等癥狀。在動物實驗中直接注射TNF-可引起低血壓，代謝性酸中毒和血液濃縮，甚至數(shù)分鐘內(nèi)致實驗動物死亡。將重組TNF-注入大鼠體內(nèi)幾分鐘后發(fā)現(xiàn)動物出現(xiàn)呼

23、吸頻率加快，換氣過度，乳酸堆積，酸中毒，繼而血壓下降。 當(dāng)TNF-被拮抗后，胰腺及肺等胰腺外臟器的炎癥與損傷被控制，低血壓被阻止，生存率提高。以抗TNF-多克隆抗體對胰腺炎大鼠進行預(yù)處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)比對照組在血淀粉酶、血鈣離子、血細胞比容、血糖等各個指標上都有明顯改善(P0.001)，從另一個方面證實了TNF-在急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。,42,牛皮癬和銀屑病關(guān)節(jié)炎(PsA)：目前，腫瘤壞死因子抑制劑正處于用于牛皮癬和銀屑病關(guān)節(jié)炎的后期階段的臨床研究階段。該藥物種類將是銀屑病關(guān)節(jié)炎市場中增長的主要驅(qū)動力。對于牛皮癬市場，該研究認為如果象預(yù)料的那樣，使用抗腫瘤壞死因子治療劑能夠相當(dāng)好地控制

24、皮膚癥狀，這些藥物也將在患有銀屑病關(guān)節(jié)炎的患者亞群中獲得特定的立足點。,43,充血性心力衰竭：重要的臨床和臨床前證據(jù)證明，充血性心力衰竭與腫瘤壞死因子的生物活性的高水平有關(guān)。該研究認為抗腫瘤壞死因子藥物的開發(fā)者將會進一步考慮該種藥物用于充血性心力衰竭。,膿毒癥：臨床試驗已適當(dāng)?shù)刈C明腫瘤壞死因子在減少死亡率方面的確切的有益的作用。,44,最新成果重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子,目前，世界上第一種重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子藥物已經(jīng)研制成功，改造后的這株腫瘤壞死因子與天然腫瘤壞死因子相比，毒性降低了90倍，對腫瘤細胞的殺傷活性提高100到1000倍，對腫瘤生長抑制率達到了60%以上 。這種藥物適用于聯(lián)合化療對實體瘤進行治療，無明顯副作用。經(jīng)過500多名腫瘤患者的臨床應(yīng)用，這一基因工程藥物對胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、頭頸部腫瘤等惡性腫瘤的治療有效率達到27.86%，尤其對非小細胞肺癌的治療有效率達到50%。,45,腫瘤壞死因子的臨床研究,感染性休克 ：目前認為革蘭氏陰性桿菌或腦膜炎球菌引起的彌漫性血管內(nèi)凝血、中毒性休克是由于細菌