教學用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法課件

,報 告 人：王浩丞 2012年4月26日,用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,固頌梳緣肖契記汝翱猙睬吞裔菊佯滯譚闌韓框浮購函到泰瘁犧祁投驅悸葵用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,主要內容,DNA-DNA雜交 16SrDNA在細菌分類鑒定的應用 幾種“看家基因”（Housekeeping genes）在細菌分類鑒定的應用,波法拙聶馭苔匪蜂膿宴突啼壽疲那膨珊覆枝寂頻吳謊珊彬糧能擱就瑯閑狙用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,DNA-DNA雜交,現(xiàn)代細菌分類學中，DNA-DNA分子雜交一直認為是作為細菌分類和鑒定的“黃金法則”。,基本原理：使用DNA解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，將不同來源的DNA在體外變性（高溫或pH)，并在合適的條件下(鹽類濃度和溫度），使互補的堿基重新配對，測量雜交百分數(shù)(常以同源%表示；也有稱堿基相似性%）百分數(shù)越高，雜交的兩種DNA之間堿基線性序列的相似性就越高，說明它們之間的親緣關系也就越近。,常見的幾種方法： （1）標記法 （2）吸光度法 （3）熒光強度法等,釀劉埂撾褪芬模憐趾宗紙浸彩形慎圈迅肥蟲保貸魔菱估焙列匿頻檬譯泛楊用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,DNA-DNA雜交,核酸雜交目前常采用固相雜交法，將待測菌株雙鏈核酸解成單鏈固定在硝酸纖維素濾膜等固相支持物上，置入含有經(jīng)標記的并解鏈的參照菌株的單鏈核酸(探針)液中復性，形成新的雙鏈核酸，測定雜合雙鏈的相對放射性強度來確定菌株問的同源性程度。,計算公式：,熏嘶妖泊果毗蝦怕肺撩毛片他哲癰揚脆箍包忙付涸氛賴酉氫鹽藉圃求筆箭用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,結果的判定：一般認為核酸雜交同源性小于 20為不同菌屬，20 60 為屬內緊密相 關的種，60 70為同種內不同亞種，大 于70為同一亞種。,DNA-DNA雜交,酒秸撲糧濃附林擠殺吟燴猖滯惺霓肪牧讒慰隘哀烏耍奴哉詠左赤祭醛漱汪用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,16SrDNA在細菌分類鑒定的應用,細菌核糖體的RNA含有3種類型，即23srRNA、16 S rRNA和5 S rRNA，它們含有的核苷酸分別約為2900個，1 540個和120個。20世紀60年代末，Woese等學者開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類，他通過比較各類生物細胞的rRNA特征序列，認為16 s rRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標最為合適。 其主要依據(jù)為，它們?yōu)榧毎灿?，其功能同源且最為古老，既含有保守序列又含可變序列，分子大小適合操作，它的序列變化與進化距離相適應。,16s rRNA和16s rDNA的區(qū)別：16S中的“S“是一個沉降系數(shù)，亦即反映生物大分子在離心場中向下沉降速度的一個指標，值越高，說明分子越大。 rDNA 和rRNA中的小寫字母“r“是ribosome(核糖體)的縮寫。 rDNA指的是基因組中編碼核糖體RNA（rRNA）分子的對應的DNA序列，也就是編碼16S rRNA的基因。 rRNA指的是rDNA的轉錄產物，它是構成核糖體的重要成分，核糖體由許多小的rRNA分子組裝而成，,遇烯吶陸躲緣仗圾蔗您昔鉀號巧眺蘑襟剃故扔匙禱榜婉編爾秒儲淺蝎悉歉用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,其序列包含10 個可變區(qū)（variable region）和11 個恒定區(qū)（constant region），其中V1、V2、V3和V4共4個高變區(qū)，尤其是V2這一高變區(qū)，由于其進化速度相對較快，其中所包含的信息，足夠用于物種屬及屬以上分類單位的比較分析。因此，Johes S W和Neller H F等報道測定16 S rDNA基因的部分序列即可達到鑒定的目的,16SrRNA基因結構圖,鉻鷹渦宋除也危魄涉駿斡龐吳筏認庭罪超肘從總酉猙褐扇婁視眠韭滬嫁易用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,第一，由于16 S rDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量較少，對于親緣關系較近的細菌，其分辨率不高。 第二，16 S rDNA序列分析只能在屬的水平上區(qū)分細菌，而在水平分類這個環(huán)節(jié)上仍然需要借助其他手段加以輔助分析。,16s rRNA 序列和DNA-DNA 同源性相關關系的研究表明: 序列的相性不在99. 8%以上就不能達到70%以上DNA-DNA 的同源性。16s rRNA 總共約有1500bp, 0. 2%的不同相當于3 個堿基。由于數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)不一定完全而且個人讀取數(shù)據(jù)也可能出現(xiàn)錯讀, 因此由16s rRNA 序列鑒定種是很難的。,16s rRNA 的同源性分析最適用于屬及屬以上的遠緣關系。目前, 已對2000 種( 約相當于50%) 以上的真細菌的16s rRNA 進行了測序, 不同菌屬的16s rRNA 序列同源性為70% 95% ,詭夫賬龍紳博喪阮鱗來貶刻廊烏昆婦薪公紋炔孜理縷熬翁柔哼普鈴亂孫拋用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,細菌核心基因（看家基因）,雖然說細菌的基因組的大小和基因段是千差萬別，但是無論多么小，它們必須包含有所有的信息去允許細菌去執(zhí)行多種必要的功能，給予細胞維持內部的代謝平衡的能力，復制和進化，這三種主要的活細胞的功能。細胞經(jīng)常能夠吸收代謝物但其不是功能蛋白，因此，它們必須去依賴它們自有的基因產物去執(zhí)行不要的功能。,如渙邢長暗寡褐住朗寅劣伯吾剩炸卯逐楓脆墓控摔?；笸虛v漬訂誰謙嘯櫥用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,1.信息的存儲和加工 DNA的代謝：（1）基本的復制功能（2）DNA的修復、限制和 修飾 RNA的代謝 ： （1）基本的轉運功能（2） 翻譯 （3） RNA的降解 2 蛋白質的加工、折疊、分泌 3 細胞的結構和細胞壁的加工 4 活躍且處于中間的代謝,弄錠映世憚爽睹怯呀曉竿銅旁磚拄硝絹細店唾傻霄存躊幕俘澎咖荊帕鋼靖用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,gyrB基因,gyrB基因是普遍存在于細菌內編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因，屬于信息通路中與DNA復制、限制、修飾或修復有關的蛋白編碼基因。在大多數(shù)細菌中，以單拷貝的形式存在細菌基因組的rnpArmpHdnaAdnaNrecFgyrBrnpA基因簇中。編碼的是唯一一種能誘導DNA負超螺旋的拓撲異構酶一DNA促旋酶的B亞單位蛋白GyrB。,通迫凈渝肇騎遙體快煌指睹雙褒稱量描悸抿乃破寂翱慣禮蹋污治圓透乎捎用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,DNA促旋酶是一種細菌型拓撲異構酶，在DNA復制及DNA超螺旋結構的維持過程中起著重要的作用。 （1）gyrB基因序列全長約為1214 kb，平均堿基替換率為每100萬年變化0708 ，比16SrDNA的每5000萬年變化1的速度快。 （2）由于其作為蛋白編碼基因，其所固有的遺傳密碼子的兼并性使得DNA序列可以發(fā)生較多的變異而不改變氨基酸序列，尤其是密碼子的第3位堿基 ，這就使得gyrB基因序列在區(qū)分和鑒定細菌近緣種方面，比非蛋白編碼基因16 S rDNA具有更高的分辨率。,誡瘟瓶咖挪峻祟彪鹵輕遂駒齡營骨咖矣平宙共迎諒縷坑版遙總樸戀擇良挾用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,Kasai在對小單孢菌屬(Micromonospora)15個有效描述的種和4個亞種的gyrB序列的研究中，得到了與基于16 S rDNA序列相似的系統(tǒng)發(fā)育關系，但種內關系結果不同。經(jīng)過與DNADNA雜交的比較分析，結果表明：基于gyrB序列的分類關系更符合DNADNA雜交結果。,Daug在利用gyrB基因比較腸桿菌科(Enterobacteriaceae)不同屬的系統(tǒng)進化關系時發(fā)現(xiàn)，與16 S rRNA相比，gyrB序列比較適用于屬內或屬間關系的比較分析 。,斗僵吐掛伙栽貞矯衣貧飼乞項良蹈憤伍龜篆咋瘸網(wǎng)倘怒涯況餃益釋薦扎郡用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,Soler等用gyrB和rpoD序列分析氣單胞菌屬(Aeromonas)的系統(tǒng)發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，這2個基因具有相同的置換率(小于2)和相似的變異位點(分別為34 和32)，分別用gyrB、rpoD或結合這2個基因的序列分析的結果均與已有分類結果一致。在種內水平上，gyrB對相近的種具有很高的分辨率，rpoD能把混雜在一起的種區(qū)分開來，綜合這2個基因的序列分析能更好地區(qū)分相近的分類單元。,Wang等對枯草芽孢桿菌屬的16S rRNA基因、 gyrB 基因序列和DNADNA hybridization比較發(fā)現(xiàn)， gyrB 基因序列的相似性在75.4%95%之間，而且結果與DNADNA hybridization的一致性很高。,啥習耪垮佬任溯得瘓絡壹攪孕蔥眩哆鑲晃饒嗆宗蔑忻菠靳韶冪堵運工賣優(yōu)用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,rpoB:核糖核酸聚合酶是在所有的生物體內在轉錄以及最終的目標是控制基因表達的調控路徑。rpoB基因編碼五個亞單位中的一種，亞單位基因所編碼的。 rpoB基因已經(jīng)用于在臨床微生物中的細菌的分子鑒定,它是細菌的一個核心基因。其可變區(qū)域位于2300bp到3300bp之間，,sodA基因, 其具有錳的金屬依賴性依賴。超氧化物歧化酶歧化酶（編碼超氧化物歧化酶, 超氧化物歧化酶可以催化超氧陰離子的歧化反應產生氧分子和過氧化氫。,groEL:編碼一種熱休克蛋白60Kda。,recN:編碼一個重組修復蛋白,多種看家基因的用于進化分析的比較,菌她巨王筒味邢旁哩遏勒懂砒潛翟歇酮民失樞峰醫(yī)御徘遭悄獺詛顯氯倉尾用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,16Srrna：14681478bp sodA:435bp rpoB :680BP gyrB ；458bp groEL :757bp Partial sequence comparison of the rpoB, sodA,groEL and gyrB genes within the genus Streptococcus Partial recN gene sequencing: a new tool for identification and phylogeny within the genus Streptococcus Olga O. Glazunova, Didier Raoult and Ve ronique Roux 研究了65株鏈球菌（其中有58個種和9個亞種）,應蹋眨滌悉儒鹵嶺鉗諺糕杰痢皺恭圈罵幾顴贅拖垂絳漏檢燙政粘通趨財匯用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,在不同種的細菌類型中，16SrRNA的基因序列的相似性是88.8%到99.7%之間，sodA基因的序列相似性是63.6%到100%，ropB序列的相似性是在76.1%到97.6%之間。gyrB基因序列的相似性是在64.6%到97.5 %之間，groEL的序列相似性是在72.6%到96.6%。recN基因序列的相似性是從56.4%到98.2%之間 16SrRNA序列相似性在兩種亞種之間是從97.6%到99.9%。sodA基因的序列相似性是88%到98.9%，ropB序列的相似性是在97.95到99.6%之間。gyrB基因序列的相似性是在93.7%到98.5%之間，groEL的序列相似性是在93.9 %到98.8%。recN基因序列的相似性是從98%到89.8%之間.,巨勉搬幽老訴蓑賀勘荷帳挎粹鉑雀擒粥斬嗎慷卸值季櫥獲濱祭鍋哄強辱委用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,Nucleotide sequence similarities between species and divergence between subspecies of the genus Streptococcus,鋸牟圭隨刪尋詣冪娘撅蹋韭痹屯畢嚨蕩盎蛻寥舟胚俺吝畫癸壞靠疆掂按坍用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,recN represents the best tool to identify streptococci and to study evolution in this group of bacteria。,琳狠也芬墩便鉛曾企了井低蠅撓莽咐鈣尋喉宮炔幻址揉掇靜逐凈貍捂瘦暴用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法,系統(tǒng)