GB15981-1995消毒與滅菌效果的評價方法與標準.pdf

中華 人 民 共 和 國 國 家 標 準 之 山 日邑 卜 二二 下 丁-A W S P&住1內人 言 布 石人任 二: +七二f = . & 淚每勺火 困雙未t f 9 1拼力達勺你淮G B 1 5 9 8 1 一1 9 9 5 E v a l u a t i n g me t h o d a n d s t a n d a r d f o r t h e e f f i c a c y o f d i s i n f e c t i o n a n d s t e r i l i z a t i o n 第一篇壓力蒸汽滅菌效果評價方法與標準1 主題內容與適用范圍 本方法規(guī)定了壓力蒸汽滅菌技術標準及其評價滅菌效果的檢測方法。 本方法適用于對壓力蒸汽滅菌設備滅菌效果的評價 。2 試劑 本標準所用試劑， 凡未說明規(guī)格者， 均為分析純（ A R ) ， 水為蒸餾水。2 . 1 蛋白陳 。2 . 2 葡萄糖。2 . 3 嗅甲酚紫酒精溶液： 取澳甲 酚紫2 . O g ， 溶于1 0 0 m L 9 5 乙 醇中。2 . 4 澳甲酚紫蛋白陳水培養(yǎng)基配制： 蛋白臟 1 0 . O g , 葡萄糖 5 . O g ， 溶于1 0 0 0 mL蒸餾水中， 調p H值至7 . 0 -7 . 2 ， 然后再加2 %澳甲酚紫酒精溶液0 . 6 mL ， 搖勻后， 按 5 mL 管， 分裝包口， 置壓力蒸汽滅菌器中， 于 1 1 5 C滅菌 4 0 m i n 后備用。3 指示菌 嗜熱脂肪桿菌芽胞( A T C C 7 9 5 3 或S S I K 3 1 ） 菌片， 含菌量為5 X 1 0 -5 X 1 0 6 c f u 片， 1 2 1 C下， 殺滅9 0 微生物所需時間D 12 ， 值為 1 . 3 -l . 9 m in ， 殺滅時間（ K T值） 為夏1 9 m in ， 存活時間（ S T值） 為）3 . 9 mi n o4 化學指示劑 需用衛(wèi)生部批準的化學指示劑 。5 技術要求 壓力蒸汽滅菌器壓力， MP a / c m 2溫度， C滅菌時間， m m 下排氣式0 . 0 7 0 1 1 5 4 0 0. 10 5 12 1 30 預真空式0 . 2 1 0 1 3 4 4 6國家技術監(jiān)督局 1 9 9 5 一 1 2 一 1 5 批準1 9 9 6 一 0 7 一 0 1 實施 G s 1 5 9 8 1 一 1 9 9 56 檢測方法6 . 1 生物學指標（ 用作壓力蒸汽滅菌設備滅菌效果的依據(jù)） 。6 . 1 . 1 將嗜熱脂肪桿菌芽胞菌片兩個分別放入滅菌小紙袋 內， 置于標準試驗包中心部位。6 . 1 . 2 滅菌柜室內， 上、 中層中央和排氣口處各放置一個標準試驗包（ 由3 件平紋長袖手術衣， 4 塊小手術巾， 2 塊中手術巾， 1 塊大手術巾， 3 0 塊 l 0 c m X l 0 c m, 8 層紗布敷料包裹成2 5 c m X 3 0 c m X 3 0 c m大小） 。手提壓力蒸汽滅菌器用通氣貯物盒（ 2 2 c m X 1 3 c m X 6 c m） 代替標準試驗包， 盒內盛滿中試管， 指示菌片放于中心部位兩只滅菌試管內（ 試管口用滅菌牛皮紙包封） ， 將盒平放于手提壓力蒸汽滅菌器底部。6 . 1 . 3 經(jīng)一個滅菌周期后， 在無菌條件下， 取出標準試驗包或通氣貯物盒中的指示菌片， 投入澳甲酚紫葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中， 5 6 C培養(yǎng)4 8 h ， 觀察培養(yǎng)基顏色變化。6 _ 2 化學指標 在物品包外用化學指示膠帶 ， 可作為物品是否經(jīng)過滅菌的處理標志。 在物品包 內中心部位用化學指示劑， 可作為物品是否滅菌的參考標志。7 結果判定及評價7 . 1 同次檢測中， 標準試驗包或通氣貯物盒內， 每個指示菌片接種的澳甲酚紫蛋白陳水培養(yǎng)基全部不變色， 判定為滅菌合格。指示菌片之一接種的澳甲酚紫蛋白陳水培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色時， 判定為滅菌不合格。7 . 2 化學指示劑的顏色變?yōu)榕c滅菌合格標準色相同時， 或熔化時作為滅菌合格的參考標準。 第二篇紫外線表面消毒效果評價方法與標準8 主題內容與適用范圍 本方法規(guī)定了物體表面消毒用紫外線的波長、 強度及評價其消毒效果的物理學指標和生物學檢測方法 。 本方法適用于紫外線直接照射到的物體表面消毒效果評價。9 指示菌9 . 1 大腸桿菌（ 8 0 9 9 或A T C C 2 5 9 2 2 ) .9 . 2 枯草桿菌黑色變種芽胞（ A T C C 9 3 7 2 ) .1 0 物理學指標1 0 . 1 在電壓2 2 0 V時， 普通3 0 W直管型紫外線燈， 在室溫為2 0 - 2 5 的使用情況下， 2 5 3 . 7 n m紫外線輻射強度（ 垂直l m處） 應）7 0 II W/ c m 2 01 0 . 2 在電壓 2 2 0 V時， 高強度紫外線燈 ， 在室溫為 2 0 - 2 5 的使用情況下 ， 2 5 3 . 7 n m 紫外線輻射強度（ 垂直l m處） 應2 0 0 t W/ c m 2 01 0 . 3 照射劑量按式（ 1 ) 計算 ： 劑量妞W s / c m2 ） 二強度印W/ c m 2 ) X時間（ s ) （ 1）1 1 檢測方法1 1 . 1 物理學檢測方法1 1 . 1 . 1 燈管的紫外線強度（ rL W / c m2 ） 用中心波長為2 5 3 . 7 n m的紫 外線強度測定儀（ 標定有效期內） ，在燈管垂直位置 l m處測定。 G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 51 1 - 1 . 2 在實際應用中消毒表面的照射強度應以燈管與消毒對象的實際距離測定。1 1 - 1 . 3 表面消毒接受的照射劑量， 應達殺滅目標微生物所需。對大腸桿菌， 照射劑量應達到 2 0 0 0 0K W s / c m z ， 對枯草桿菌黑色變種芽胞應達到1 0 0 O O O JA W s / c m 2 ,1 1 . 2 生物學檢測方法1 1 . 2 . 1 采用載體定量消毒試驗 。載體制備按本標準附錄 C進行 。1 1 . 2 . 2 開啟紫外線燈 5 min 后 ， 將 8 個染菌玻片平放于滅菌器皿中， 水平放于適當距離照射 ， 于 4 個不同間隔時間各取出2 個染菌玻片， 分別投入2 個盛有5 m L洗脫液（( 1 吐溫8 0 , 1 蛋白陳生理鹽水） 試管中， 振打8 0 次。1 1 . 2 . 3 經(jīng)適當稀釋后， 取。 . 5 m L洗脫液， 作平板傾注， 每個染菌玻片接種兩個， 放 3 7 培養(yǎng)4 8 h 作活菌計數(shù)。1 1 . 2 . 4 陽性對照， 除不作照射處理外， 取2 個染菌玻片分別投入么 個盛有5 m L洗脫液中振打8 0 次，余按 4 . 2 . 3 進行。1 1 . 2 . 5 計算殺滅率 ， 。 、 陽性對照回收菌數(shù)一試驗組 回收菌數(shù) 、 ， ， 殺 滅率 （ ） 1 Iti l y J N H書 vln r y a s n 月 IW 7 S 1 L H - 1 r X 1 0 0 . . . （ 2） i J . I 、 一 、 陽性 對照 回收菌 數(shù)1 2 判定標準1 2 . 1 對指示菌殺滅率9 9 . 9 判為消毒合格。1 2 . 2 達物理學檢測標準時， 作為消毒合格的參考標準 。 第三篇液體消毒劑消毒效果評價方法與標準1 3 主題內容與適用范圍 本方法具體規(guī)定了消毒劑消毒效果生物學檢測方法及其評價標準。 本方法適用于消毒劑對各種物體的消毒效果評價。1 4 理化指標 將消毒劑置 2 0 士2 C 水浴中， 測定在使用濃度下殺滅指示微生物達到消毒或滅菌所需的最短時間( mi n ) 。1 5 指示微生物1 5 . 1 細菌1 5 . 1 . 1 細菌繁殖體： 金黃色葡萄球菌（ A T C C 6 5 3 8 ) 、 大腸桿菌（ 8 0 9 9 或A T C C 2 5 9 2 2 ) ,1 5 . 1 . 2 細菌芽胞： 枯草桿菌黑色變種芽胞（ A T C C 9 7 3 2 ) ,1 5 . 2 真菌： 白色念珠菌（ A T C C 1 0 2 3 1 ) .1 5 . 3 乙型肝炎表面抗原： 純化抗原（( 1 . O m g / m L ) ,1 6 檢測方法1 6 . 1 中和試驗（ 見附錄A) .1 6 . 2 消毒劑定性消毒試驗（ 見附錄B ) ,1 6 . 3 消毒劑定量消毒試驗（ 見附錄C ) o1 6 . 4 消毒劑殺菌能量試驗（ 見附錄D ) o1 6 . 5 乙型肝炎表面抗原（ H B s A g ） 抗原性破壞試驗（ 見附錄E ) , G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 51 了 消毒效果評價標準1 7 . 1 對細菌和真菌的殺滅率）9 9 . 9 %， 對H B s A g ， 將檢測方法靈敏度1 0 倍或 5 X1 0 倍（ 載體試驗）的H B s A g 抗原性破壞， 可判為消毒合格。1 7 . 2 對枯草桿菌黑色變種芽胞全部殺滅 ， 可判為滅菌合格。1 7 . 3 在實際應用中消毒效果評價以有機物保護試驗的最低濃度和最短時間為該消毒劑達到實用消毒所需的濃度和時間。 2 59 G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 5 附錄A 中和劑中和效果試驗 （ 補充件）A 1 內容提要 為了準確評價消毒劑對微生物的殺滅作用， 消毒試驗中要求選擇適當中和劑。 所選中和劑不僅能及時中止消毒劑的殺微生物作用， 且 中和劑本身及其與消毒劑的反應產物（ 下稱中和產物） 尚需對微生物無抑制或殺滅作用， 對培養(yǎng)基無不 良影響 。A 2 培養(yǎng)基和試劑A 2 . 1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 成分： 蛋白陳1 0 . 0 館 牛肉膏3 . O O g 氯化鈉5 . O O g 瓊脂1 5 . O O g 蒸餾水1 0 0 0 . O O m L 制法 ： 除瓊脂外 ， 其他成分溶解于蒸餾水中， 調 p H至 7 . 2 -7 . 4 ， 加入瓊脂后加熱溶解 ， 過濾分裝， 經(jīng)1 2 1 C、 壓力蒸汽作用 3 0 m i n ， 滅菌后備用。A 2 . 2 0 . 0 3 m o 1 / l , 磷酸鹽緩沖液 （ p H7 . 2 -7 . 6 ， 下稱 P B S ) . 成分： 磷酸氫二鈉2 . 8 4 g 磷酸二氫鉀1 . 3 6 g 蒸餾水1 0 0 0 . O O m L 制法： 將磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀溶解于蒸餾水中， p H為7 . 2 -7 . 4 ， 分裝， 經(jīng)1 2 1 0C , 3 0 m i n壓力蒸汽滅菌后備用。A 3 器材A 3 . 1 錐形燒瓶。A 3 . 2 平皿（ 直徑 9 c m) oA 3 . 3 量筒。A 3 . 4 精密 p H試紙 。A 3 . 5 無菌試管。A 3 . 6 無菌刻度吸管（ 1 . 0 , 5 . O , 1 0 . O m L ) oA 3 . 7 恒溫培養(yǎng)箱。A 3 . 8 冰箱。A 3 . 9 菌落計數(shù)器 。A 3 . 1 0 酒精燈。A 4 中和劑（ 注明生產廠家， 批號）A 5 操作方法A 5 . 1 用 P B S將指示菌制成 5 X 1 0 5 -5 X 1 0 6 c f u / m L懸液。 G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 5A 5 . 2 將 消毒劑用滅菌蒸餾水配制成 3 種不同濃度， 在不加中和劑的情況下， 測知該消毒劑 l O m m抑殺指示菌9 9 . 9 以上的最低有效濃度。A 5 . 3 取消毒劑l O m m抑殺指示菌的最低有效濃度與待選擇中和劑進行試驗， 選出中和劑種類并依據(jù)等當量中和原則， 調整中和劑濃度， 選出試驗濃度的消毒劑使用中和劑的濃度。A 5 . 4 中和劑選擇試驗時， 先將消毒劑1 . O mL與中和劑溶液 9 . O m L混合， 制成中和產物溶液， 再按表Al 分組進行。 表 A l 中和劑選擇試驗月才拼 然后， 傾注平板置3 7 C 培養(yǎng)4 8 h ， 計數(shù)菌落數(shù)， 按稀釋倍數(shù)計算出回收菌數(shù)（ c f u / m L ) oA 6 中和試驗結果報告方法（ 如表A 2 ) 表 A 2 中和試驗結果舉例份片$-QIftM f ,cfu/mL3 4 5 64. 67 X 106 4. 83 X 106 4. 11 X 106 05.81X106 5.89X106 5.78X106 03.31X106 5.31X106 5.21X106 03.20X10 5. 03 X 106 5. 18 X 106 0卜 3 , 4 , 5 組間誤差率計算公式誤 差 率 （ ， 一 于R - 3 gli f t C I+ I 9fl 粵4 9 黔I+ 1- 911J 911j=-一X 1 0 0 （Al）A 7 判定標準A 7 . 1 3 , 4 , 5 組菌數(shù)相似 ， 其誤差率1 0 %.A 7 . 2 6 組無菌生長 。A 7 . 3 2 組菌數(shù)明顯少于 3 , 4 , 5 組 。A 7 . 4 1 組不長菌或明顯少于 2 組 。 符合上述標準的中和劑表明可消除消毒劑對指示菌的作用 ， 中和劑及其與消毒劑的中和產物對指示菌無毒害， 判定為該消毒劑的中和劑。A 8 消毒試驗用中和劑濃度的選擇 按A 5 . 4 步驟進行， 按A 7 . 1 -7 . 4的標準判定。 G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 5 附錄B 消毒劑定性消毒試驗 （ 補充件）B 1 內容提要 定性消毒試驗是測定受消毒因子作用后的樣本有無細菌生長的試驗方法。用于對消毒因子滅菌效果的鑒定和消毒劑殺滅細菌效果的初步評價。B 2 培養(yǎng)基與試劑B 2 . 1 普通肉湯培養(yǎng)基B 2 . 1 . 1 成分： 蛋白陳1 0 . o o g 氯化鈉5 . o o g 肉浸液1 0 0 0 . O o m LB 2 . 1 . 2 制法： 取蛋白陳、 氯化鈉加入肉浸液內， 微溫溶解， 調節(jié)p H至弱堿性， 煮沸、 濾清， 調節(jié)p H使滅菌后為 7 . 2 -7 . 4 ， 壓力蒸汽滅菌備用。B 2 . 2 試劑B 2 . 2 . 1 稀釋液： 含1 蛋白陳的0 . 0 3 mo 1 / L P B S ( p H 7 . 2 .7 . 4 ) .B 2 . 2 . 2 滅菌蒸餾水。B 2 . 2 . 3 中和劑 ： 按本標準附錄 A選擇。B 3 器材B 3 . 1 滅菌刻度吸管（ 1 . 0 , 5 . 0 , 1 0 . O m L ) oB 3 . 2 滅菌試管。B 3 . 3 滅菌三角燒瓶。B 3 . 4 酒精燈。B 3 . 5 恒溫水浴箱。B 3 . 6 恒溫培養(yǎng)箱。B 4 試驗方法B 4 . 1 將菌液進行活菌計數(shù)， 并用稀釋液配制成含菌量為5 X 1 0 5 - 5 X 1 o c f u / m L的菌懸液。B 4 . 2 將滅菌試管t o 支排列于試管架上， 標記管號。B 4 . 3 每個試管加滅菌蒸餾水 2 . 5 m L ， 放 2 0 士2 水浴中。B 4 . 4 于第 1 管內加適當濃度消毒液 2 . 5 m L ， 混勻后取 2 . 5 m L移入第 2 管 ， 再次混勻 ， 從第 2 管中取2 . 5 m L移入第3 管， 以此類推至第9 管， 混勻后棄去2 . 5 m L， 第1 0 管中不加消毒液作對照。B 4 . 5 加菌懸液2 . 5 m L于各管中， 混勻并記錄各管加菌時間， 使菌藥混合液中含菌量均為1 0 5 - 1 0 6c f u / mL oB 4 . 6 各管分別于加菌后4 個不同間隔時間， 取出0 . 5 mL ， 加入4 . 5 mL中和劑內， 中和1 0 m in后， 取出0 . 5 mL加入4 . 5 mL營養(yǎng)肉湯管內。B 4 . 7 將接種細菌的肉湯管放 3 7 培養(yǎng) 4 8 h ， 觀察初步結果 ， 無菌生長管繼續(xù)培養(yǎng)至第 7 天。B 4 . 8 試驗重復 5 次。 G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 5B 5 結果判定B 5 . 1 若 肉湯管混濁 ， 則表示有菌生長， 記為陽性 ， 以（ ） 表示。B 5 . 2 若培養(yǎng)至第7 天， 肉湯管澄清， 則表示無菌生長， 記為陰性， 以（ 一） 表示。B 5 . 3 對難以判定的肉湯管， 取0 . 1 mL接種于營養(yǎng)瓊脂平板， 用滅菌L棒涂勻， 放3 7 培養(yǎng)4 8 h ， 觀察菌落形態(tài) ； 并做涂片染色鏡檢 ， 判斷是否有指示菌生長。有指示菌生長記為陽性 。B 5 . 4 5 次試驗， 均無指示菌生長表示達到滅菌。 附錄c 消毒劑定A消毒試驗 （ 補充件）c 1 內容提要 定量消毒試驗是測定受消毒因子作用后 ， 樣本殘存微生物數(shù)量的試驗方法 ， 以殺滅率表示結果 。用于對消毒劑殺滅效果的評價。c 2 培養(yǎng)基與試劑C 2 . 1 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 ： 按本標準 A 2 . 1 制備 。C 2 . 2 試劑C 2 . 2 . 1 稀釋液： 含1 蛋白陳的0 . 0 3 m o l / L P B S ( p H 7 . 2 - 7 . 4 ) ,C 2 . 2 . 2 滅菌蒸餾水。C 2 . 2 . 3 中和劑 ： 按本標準附錄 A選擇。C 2 . 2 - 4 0 . 0 3 m o l / L P B S ( p H 7 . 2 -7 - 4 ) 。C 2 . 2 . 5 洗脫液： 含中和劑、 1 蛋白陳 0 . 1 吐溫8 0 的P B S oc 3 器材C 3 . 1 滅菌刻度吸管（ 1 . 0 , 5 . 0 , 1 0 . O m L ) aC 3 . 2 滅菌試管。C 3 . 3 滅菌三角燒瓶。C 3 . 4 滅菌平皿 （ 直徑為 9 c m) .C 3 . 5 恒溫水浴箱。C 3 . 6 恒溫培養(yǎng)箱。C 3 . 7 酒精燈 。C 3 . 8 菌落計數(shù)器。c 3 . 9 微量進樣器。C 3 . 1 0 載體： 根據(jù)需要及試驗目的選用經(jīng)脫脂處理0 . 5 c m X 1 . O c m大小的布片、 紙片、 玻片、 橡膠片、 塑料片、 不銹鋼片或鋁片。C 4 試驗方法C 4 . ， 定量懸液試驗C 4 . 1 . 1 將菌液進行活菌計數(shù)， 并用稀釋液稀釋成含菌量為5 X 1 0 -5 X 1 0 6 c f u / m L的菌懸液。C 4 . 1 . 2 將消毒劑用滅菌蒸餾水稀釋成3 個不同濃度， 各吸取4 . 5 m L分別加入三個試管內， 放2 0 士 G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 52 C 水浴中。C 4 . 1 . 3 待試管內液體溫度與水浴溫度平衡后 ， 在三 個試管 中分別加入 0 . 5 m I , 菌懸液 （ 含菌量為 5 X1 0 -5 X 1 0 6 c f u / m l J ) ， 混勻并開始記時。C 4 . 1 . 4 分別于 4個不同間隔時間， 各取 0 . 5 m L菌液混合液移入 4 . 5 m L中和劑中混勻。C 4 . 1 . 5 中和l 0 m i n ， 作適當稀釋后進行活菌計數(shù)。C 4 . 1 . 6 陽性對照以洗脫液代替消毒液， 同時按C 4 . 1 - 2 -C 4 . 1 . 5 進行。C 4 . 1 . 7 按不同稀釋度推算出每個樣本存活菌數(shù)（ c f u / mL ) ， 按式（ C 1 ) 計算殺滅率： 二 。 、 對照組存活菌數(shù)一試驗組存活菌數(shù) 、 ， ， 。， 。 1、 殺滅率（ ） 二絲巴已 I J I 興拾甚 =1 L i i 7 H m X 1 0 0- r1 U 7 7 !.a -,F- s -A L : 114 , “ “ “ （ C l） 小八-I - / u i 一對照組存活菌數(shù) 、 “、 C 4 . 1 . 8 試驗重復 5 次。C 4 . 2 載體定量試驗C 4 . 2 . 1 將滅菌載體平放于滅菌平皿內， 每個載體滴注定量菌液（ 載體回收菌量達 5 X1 0 5 - 5 X1 0 6c f u 片） ， 涂勻， 放3 7 培養(yǎng)箱待干。 應用市售染菌載體時， 回收菌量亦應達5 X1 0 5 - 5 X 1 0 6 c f u 片） 。C 4 . 2 . 2 用滅菌蒸餾水將消毒劑稀釋成3 個不同濃度， 各吸取 5 mL分別加入三個試管內， 放2 0 士2 C水浴中。C 4 . 2 . 3 待試管內液體溫度與水浴溫度平衡后， 加入染菌載體， 作用至規(guī)定時間， 將染菌載體移入含中和劑的5 m L洗脫液試管內， 中和l O m in ， 振打8 0 次， 適當稀釋， 接種兩個平板。 放3 7 培養(yǎng)2 4 -4 8 h ， 進行活菌計數(shù)。C 4 . 2 . 4 陽性對照， 以洗脫液代替消毒液按 C 4 . 2 . 2 -C 4 . 2 . 3 進行 。C 5 結果判定C 5 . 1 5 次試驗的殺滅率均）9 9 . 9 判為消毒合格。C 5 . 2 對枯草桿菌黑色變種芽胞5 次試驗均全部殺滅判為消毒合格。 附錄D 有機物保護試驗 （ 補充件）D 1 內容提要 有機物保護試驗是測定消毒劑對有機物保護條件下的微生物的殺滅作用 ， 以殺滅率表示之 ， 其結果與該消毒劑定量消毒試驗相比較 ， 用于評價有機物對消毒劑的殺菌能力的影響 。D 2 培養(yǎng)基與試劑D 2 . 1 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 ， 按本標準 A 2 . 1 制備。D 2 . 2 試齊 ， ：D 2 . 2 . 1 稀釋液 ： 同 C 2 . 2 . 1 0D 2 . 2 . 2 滅菌蒸餾水。D 2 . 2 . 3 中和劑 ： 按本標準附錄 A進行選擇。D 2 . 2 - 4 0 . 0 3 m o 1 / L磷酸緩沖液（ p H 7 . 2 - 7 . 4 ) （ 簡稱 P B S ) oD 2 . 2 . 5 洗脫液 ： 含 1 蛋白膝 1 0 . 1 吐溫 8 0 的生理鹽水。D 2 . 2 . 6 小牛血清加入菌懸液中， 使其最終濃度為 1 0 0 o 0 G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 5D 3 器材 同本標準C 3 oD 4 試驗方法D 4 . 1 實驗前預先將菌液進行活菌計數(shù) ， 用稀釋液稀釋 ， 加入小牛血清 ， 使其最終含血清量為 1 0 0 0 ， 含菌數(shù)為5 X 1 0 5 5 X I O s c f u / m L ， 以此作為試驗菌懸液。D 4 . 2 以下步驟同本標準C 4 . 1 . 2 -C 4 . 1 - 8 .D 5 結果判定D 5 . 1 5 次試驗的殺滅率均大于9 9 . 9 所需最低濃度和最短時間， 判為該消毒劑在有機物存在下， 可以達到消毒的有效濃度和時間。D 5 . 2 此有效濃度和時間與定量消毒試驗達到消毒的有效濃度和時間相 同或相近 ， 判為有機物對消毒劑殺菌作用無明顯影響。達到消毒最低有效濃度增加一倍以上或最短作用時間延長一倍以上者可視為有明顯影響。 附錄E 乙型肝炎表面抗原破壞試驗 （ 補充件）E 1 內容提要 乙型肝炎表面抗原（ H B s A g ） 破壞試驗是以H B s A g 的抗原活性為間接標志， 評價消毒因子對乙型肝炎病毒（ H B V ） 滅活能力的試驗方法。 適用于評價化學消毒劑、 紫外線對H B V的消毒效果。E 2 試劑E 2 . 1 小牛血清（ 5 6 C， 3 0 min滅活） 。IE 2 . 2 O . O l m o l / L 磷酸鹽緩沖液（ P B S , P H 7 . 2 - 7 . 4 ) .E 2 . 3 純化H B s A g ( l . O m g / mL ) oE 2 . 4 固 相放射免疫分析法試劑， 要求特異性1 0 0 0 o ， 精密性C V - - 1 5 0 o ， 靈敏度（1 . O n g / m L ， 線性； 0 . 9 5 。E 2 . 5 酶聯(lián)免疫吸附法試劑， 要求特異性 1 0 0 y , 精密性 ,V 1 5 %， 靈敏度0 . 9 5 0E 3 器材E 3 . 1 吸量器： 包括試管、 吸管（ 0 . 1 , 1 . 0 , 5 . 0 和1 0 . O mL 4 種） 和微量進樣器（ 1 0 0 . O tL L ) oE 3 . 2 載體（ 直徑1 . 5 c m大小的不銹鋼片） 。E 3 . 3 r 免疫計數(shù)儀 。E 3 . 4 酶聯(lián)免疫測定儀。E 3 . 5 低溫冰箱（ 一3 0 C一7 0 0C ) oE 4 H B s A g 懸液的配制E 4 . 1 取0 . O l m o l / l . P B S ( p H 7 . 2 -7 . 4 ) 9 . 4 m L加入小牛血清0 . 6 m L ， 配成含6 小牛血清的懸液。 再 G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 5取該P B S 9 . O m L ， 加入濃度為1 . O m g / m L的純化H B s A g 懸液1 . O m L， 使成含5 . 4 小牛血清， H B s A g濃度為1 0 0 Fc g / mL的試驗用H B s A g 懸液。E 4 . 2 將試驗用H B s A g懸液 1 . O m L盛裝入容量為 1 . 5 m L的玻璃安瓶中， 封口， 放一3 0 0C J -7 0 冰箱保存?zhèn)溆谩１４嫫跒槿齻€月。E 5 H B s A g 的檢測方法E 5 . 1 固相放射免疫分析法（ S P R I A) ,E 5 . 2 酶聯(lián)免疫吸附法（ E L I S A) oE 6 中和荊選擇 在測定消毒劑對H B s A g 的破壞效果時， 應先選出適宜的中和劑及其使用濃度， 再進行破壞試驗。 所用中和劑： a 應能有效而及時中止消毒劑的殘余作用； b 中和劑及其與消毒劑的中和產物對H B -s A g 的抗原活性沒有影響， 亦不影響檢測方法對H B s A g檢出的靈敏度。E 6 . 1 將消毒劑用無菌蒸餾水配成不同濃度， 取1 . 2 m L消毒液與。 . 3 m L H B s A g懸液混勻， 置2 0 士2 C水浴條件下， 作用l O m in , 測定該消毒劑 l O m i n 抑制或破壞H B s A g 抗原性的最低有效濃度。E 6 . 2 取消毒劑 l O m i n 抑制或破壞H B s A g抗原性的最低有效濃度與待選中和劑進行試驗， 試驗可按下列組別進行； a 消毒液 0 . 9 mL +H B s A g 懸液 0 . 1 mL ; b 消毒液0 . 4 mL + H B s A g 懸液 0 . 1 m L作用l O m in后含2 0 小牛血清的中和劑0 . 5 mL ; c 先取含2 0 小牛血清的中和劑1 m L與消毒液1 mL ， 混勻， 作用1 0 -3 0 m i n ， 制成中和產物溶液， 再行試驗。中和產物溶液0 . 9 m L +H B s A g 懸液0 . 1 mL ; d 含1 0 小牛血清的P B S O . 9 m L +H B s A g懸液 。 . 1 m L ; e 含 1 0 小牛血清的中和劑0 . 9 mL +H B s A g 懸液0 . 1 m L ; f 。 中和產物溶液0 . 9 mL +P B S O . 1 m L 。經(jīng)檢測只有在。 , d , e 組H B s A g 活性的測定值相近（ 相差1 0 以下） 并都明顯多于b 組， a 組H B s A g 活性不能檢出或檢出活性明顯少于b 組， f 組陰性對照正常，方可證明所選中和劑及其使用劑量是適宜的。E 6 . 3 進行消毒試驗時， 依據(jù)消毒劑與中和劑等當量中和原則， 適當調整中和劑的用量。 再次按E 6 . 2 步驟測定中和效果后 ， 方可進行抗原性破壞試驗。E 7 破壞試驗方法E 了 1 懸液法 懸液法指將H B s A g 在懸液中與消毒劑相互作用并進行抗原性破壞效果觀察的試驗方法。E 7 . 1 . 1 H B s A g懸液的濃度為檢測試劑靈敏度的l o 4 倍。如檢測試劑的靈敏度為l n g / mL , H B s A g的濃度應為l O t .g / m L ,E 7 . 1 . 2 取含5 小牛血清的P B S 2 . 7 m L加到含。 . 3 m L濃度為l O O tA g / m L的H B s A g 懸液中， 混勻。E 7 . 1 . 3 取小牛血清2 0 m L加到含8 0 m L滅菌的中和劑溶液中， 混勻。E 7 . 1 . 4 破壞試驗： 將預定消毒液濃度1 . 2 5 倍的消毒液與H B s A g 懸液按4： 1比例混合， 混合液容量不少于 1 . 5 m L 。 然后置 2 0 士2 水浴條件下， 作用達規(guī)定時間， 即刻取 0 . 3 m L混合液與等體積含 2 0 小牛血清的中和劑混勻， 作用 1 0 - 3 0 m i n ， 取樣測定殘留H B s A g的活性， 每一樣本平行測定 2 份， 每份0 . 1 m L ， 取其平均值 ， 判定破壞效果。 每種消毒劑觀察 3 個濃度， 每一濃度觀察 4 個作用時間。 試驗重復5 次。E T 1 . 5 陽性對照： 取含2 0 小牛血清的中和劑1 m L ， 加到含1 m L試驗用消毒液的試管中混勻， 作用1 0 - 3 0 m m， 制成中和產物溶液。 取該中和產物溶液0 . 9 m L加入試驗濃度的H B s A g 懸液0 . 1 m L取樣檢測， 每一樣本檢測3 份， 每份0 . 1 m L， 取其平均值為陽性對照值。E 7 . 1 . 6 陰性對照： 取含2 0 小牛血清的中和劑1 m L加到含1 mL試驗用消毒液的試管中， 混勻， 作用1 0 - - 3 0 m in ， 取樣檢測， 每一樣本檢測3 份， 每份0 . 1 m L取其平均值為陰性對照值。 G B 1 5 9 8 1 一 1 9 9 5 應注意陰性對照不能用試劑盒的陰性對照樣本。E 7 . 2 載體法 載體法指將在載體表面的H B s A g與消毒因子相互作用， 并進行抗原性破壞效果觀察的試驗方法。E 7 . 2 . 1 H B s A g載體的制備E 7 . 2 . 1 . 1 載體為直徑 1 . 5 c m大小的不銹鋼片 ， 經(jīng)洗滌劑煮沸洗滌脫脂、 壓力蒸汽滅菌備用。E 7 . 2 . 1 . 2 H B s A g 懸液的濃度為檢測方法靈敏度的5 X1 0 4 倍。 如靈敏度為l n g / m L, H B s A g的濃度應為5 0 t c g / m L oE 7 . 2 . 1 . 3 H B s A g的污染方法為滴染法。滴染時， 將滅菌載體平鋪于無菌平皿內， 用微量進樣器吸取H B s A g 懸液，