探討Notch信號通路對糖尿病大鼠血管平滑肌細胞mRNA影響.doc

探討Notch信號通路對糖尿病大鼠血管平滑肌細胞mRNA影響 孟凡兵1范東旭2劉麗3金松2 1吉林省長春市解放軍461醫(yī)院吉林省長春市130000 2黑龍江省佳木斯市佳木斯大學附屬第一醫(yī)院血管外科黑龍江省佳木斯市154007 3黑龍江省人民醫(yī)院血管外科黑龍江省哈爾濱市154000 【摘要】目的：探討Notch信號通路對體外培養(yǎng)糖尿病大鼠血管平滑肌細胞的mRNA水平的影響。方法：本課題從不同梯度濃度-分泌酶抑制劑(DAPT)干預(yù)Notch信號通路后對DM大鼠VSMCs基因影響進行論述。結(jié)果：通過實時定量PCR方法分析得出，加-分泌酶抑制劑（DAPT)的培養(yǎng)基的DM大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)溶解溫度峰值Tm進行檢測得出：溶解曲線呈單峰，溶解溫度在86.0-84.0之間，溶解溫度變化小，表明為特異性擴增。結(jié)論：實驗結(jié)果顯示DAPT干預(yù)Notch信號通路后，對體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趨勢，復(fù)制率下降，使其溶解溫度峰值前移，溶解曲線呈單峰，將會導(dǎo)致進一步細胞凋亡。 關(guān)鍵詞pcr；糖尿病大鼠；dapt；血管平滑肌細胞；mrna 1材料與方法 本課題前期的糖尿病大鼠模型建立、糖尿病大鼠主動脈血管病變檢測、糖尿病大鼠VSMCs體外培養(yǎng)及鑒定以及不同梯度濃度-分泌酶抑制劑(DAPT)干預(yù)Notch信號通路后對DM大鼠VSMCs活性及毒性、凋亡、細胞周期的影響均已完成，且DM大鼠VSMCs已完成凍存。僅從不同梯度濃度-分泌酶抑制劑(DAPT)干預(yù)Notch信號通路后對DM大鼠VSMCs基因影響進行論述。 1.1實驗對象 取已完成的糖尿病大鼠血管平滑肌細胞，進行細胞復(fù)蘇與傳代。 1.1.1VSMCsmRNA的抽提 取凍存已裂解的細胞，在常溫下放置到完全溶解。溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40l用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80，作為實時定量PCR擴增實的模版。 1.1.2RNA質(zhì)量檢測，紫外吸收法測定取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取260nm和280nm兩處的吸收值，測定RNA溶液的濃度和純度。進行濃度測定，在進行純度檢測，mRNA純度為mRNA溶液的A260/A280的比值，比值范圍1.9到2.1. 2反應(yīng)條件 如表1。 3引物設(shè)計軟件 PrimerPremier5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補。 根據(jù)文獻設(shè)計出相應(yīng)的引物。 目標基因： 上游引物為5:TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGCTAT3下游引物為5：GACGACCCCGAACCGCGACCGTAACAG3擴增條目的條帶大小為155bp。對照基因： 上游引物5:TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGTTAT3下游引物5：CAAGACCCCGAACCGCGACCGATACCA3擴增條目的條帶大小為156bp。 4結(jié)果 通過實時定量PCR方法分析得出，加-分泌酶抑制劑（DAPT)的培養(yǎng)基的DM大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)溶解溫度峰值Tm進行檢測看見：溶解溫度在86.084.0之間，溶解溫度單一，溶解曲線呈單峰，標明為特異性擴增。而對照組（正常培養(yǎng)基）未見特異性峰值。從PCR溶解曲線我們看見DAPT干預(yù)Notch信號通路后對體外培養(yǎng)的DM大鼠VSMCs的mRNA有抑制趨勢，使其溶解溫度峰值前移，溶解曲線呈單峰，復(fù)制率下降，將會導(dǎo)致細胞凋亡。 5結(jié)論 本課題通過實時定量PCR技術(shù)分析探討Notch信號通路在糖尿病大鼠血管再生及成熟中的作用機制，分析探討Notch信號通路對體外培養(yǎng)糖尿病大鼠血管平滑肌細胞的mRNA水平有何影響，為進一步研究糖尿病患者血管再生提供依據(jù)，有可能成為獲得更多有功能的血管以促進血管新生，為臨床治療糖尿病足潰瘍、缺血性疾病、改善預(yù)后提供新思路和新途徑，并為以后系統(tǒng)科學地研究血管再生提供方向，為缺血性疾病的治療提供靶向藥物，希望在不久之后會應(yīng)用到臨床治療中，造福廣大糖尿病足潰瘍、缺血性疾病患者，實現(xiàn)從實驗室到臨床的完整對接，進一步提升糖尿病足潰瘍、缺血性疾病治療的基礎(chǔ)研究水平。 （通訊作者：金松） 參考文獻 1金松,劉延東.糖尿病大鼠血管平滑肌細胞體外培養(yǎng)及Notch信號通路對其營養(yǎng)的研究J.佳木斯大學學報,xx3-5. 2吳護群,陳戈,盧文.糖尿病足的基礎(chǔ)知識教育及防治J.實用心腦費血管病雜志,xx,18:57. 3SteeperR.AcriticalreviewoftheaetiologyofdiabetieuropathiculcerJ.JWoundCAre.xx,14(3):101-103. 4林楚佳,林少達，黃少薇。糖尿病足下肢血管病變分析J.中國臨床研究，xx,24(4):274-276. 5楊婷,金松,劉延東.糖尿病大鼠血管平滑肌細胞原代培養(yǎng)方法的改良J.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，xx,20(2):173-176. 6黃留玉PCR最新技術(shù)原理,方法及應(yīng)用M北京：化學工業(yè)出版社,xx;131-157. 7羅勇軍，劉欣，實時熒光定量PCR標準品的制備及應(yīng)用J.重慶醫(yī)學,xx,34（30:414-415. 8管任珍.實時熒光定量PCR檢測胃癌DNA甲基化J.天津醫(yī)科大學學報,xx-03-023-5. 9梁潔，韓驊.Notch信號通路與血管發(fā)育J.細胞與分子免疫學雜志,xx-12-18，26-27. 10MorrowD,GuhaS,SweeneyC,Notchandvascularsmoothmusclecellphenotype.CircRes,xx.103(12)1370-82. 11StockhausenM，SjolundJaxelso