鼻咽癌患者血漿EBV DNA﹑ 血清CYFRA21-1 和VCA-IgA 的檢測及臨床應(yīng)用.doc

鼻咽癌患者血漿EBVDNA血清CYFRA21-1和VCA-IgA的檢測及臨床應(yīng)用孫劍光1王化修2肖方庚1劉亞林1（1邵陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院耳鼻喉科；2邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室；湖南邵陽422000）摘要目的探討血漿EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA三種腫瘤標(biāo)記物對鼻咽癌診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷的臨床應(yīng)用價值。方法分別采用熒光定量PCR法、電化學(xué)發(fā)光法和免疫酶法檢測62例鼻咽癌患者治療前、后及62例健康對照者血漿EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA含量，并進(jìn)行對比分析。結(jié)果治療前組血漿EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA的陽性率明顯高于健康對照組（P0.01）；治療后組血漿EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA含量高者，在隨訪中發(fā)現(xiàn)腫瘤殘存、復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。結(jié)論血漿EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA的檢測對鼻咽癌的早期診斷與高危人群的篩查、以及對鼻咽癌患者的療效監(jiān)測和預(yù)后判斷有重要的臨床應(yīng)用價值，三種腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合檢測有互補(bǔ)作用。關(guān)鍵詞鼻咽癌；EB病毒；EBVDNA；CYFRA21-1；VCA-IgAQuantificationandClinicalApplicationofPlasmaCell-freeEBVDNA,CerumCYFRA21-1andVCA-IgAinPatientswithNasopharyngealCarcinomaSUNJian-guang1,WANGHua-xiu2,XIAOFang-geng1,LIUYa-lin1(1.DepartmentofOtolaryngology,theAffilicatedHospitalofShaoyangMedicalCollege；2.DepartmentofPathology,ShaoyangMedicalCollege,Shaoyang,Hunan422000)Abstract:【Objective】ToinvestigatetheroleofplasmaEBVDNA,serumCYFRA21-1andVCA-IgAindiagnosis,curativeeffectsurveyandprognosisofnasopharyngealcarcinomapatients(NPC).【Methods】TheplasmaEBVDNA,serumCYFRA21-1andVCA-IgAin62nasopharyngealcarcinomapatientsand62healthycontrolswereanalyzedusingfluorescencequantitativepolymerasechainreaction,electrochemiluminescenceimmunoassay,andimmunoenzymeassay,respectively.【Results】ThepositiveratesandconcentrationsofplasmaEBVDNA,serumCYFRA21-1andVCA-IgAamongnewcaseswithNPCweresignificantlyhigherthanthoseamonghealthycontrols(P0.01).Afterthecompletionoftreatment,thepatientshadsignificantlyhigherplasmaEBVDNAandserumVCA-IgAconcentrationcomparedwithpatientswhohadnot,theresidualtumors,locoregionalrecurrenceanddistantmetastasis.【Conclusion】plasmaEBVDNA,serumCYFRA21-1andVCA-IgAdetectinhaveimportantvalueinearlydiagnosis,screeningofhighriskpopulation,curativeeffectsurveyandprognosis.Thesimultaneouscombinationtestscanriseadvantagetoeachother.【基金項目】：邵陽市科技計劃項目（Z09004）【作者簡介】：孫劍光（1963-），男，副教授，研究方向：頭頸部腫瘤防治。Keywords:nasopharyngealcarcinoma；Epstein-BarrVirus；EBVDNA；CYFRA21-1；VCA-IgA鼻咽癌（nasopharyngealcarcinomaNPC）是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤之一，病理位置隱匿，早期臨床表現(xiàn)不明顯，易被患者忽視，多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)頸部淋巴結(jié)腫大才來就診，此時已轉(zhuǎn)移。臨床上診斷鼻咽癌主要依靠影像學(xué)及鼻咽局部檢查加細(xì)胞涂片或病理活檢，早期診斷有一定困難。放療是治療鼻咽癌的主要方法，雖然隨著放療設(shè)備和技術(shù)的改進(jìn)、綜合治療的廣泛應(yīng)用，鼻咽癌的療效有了明顯提高，但治療后仍有約30%-40%的患者因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移導(dǎo)致治療失敗1。復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是鼻咽癌患者死亡的主要原因2，目前尚無監(jiān)測鼻咽癌患者治療效果的有效方法。本研究通過血漿EBVDNA、血清CYFRA21-1和VCA-IgA的檢測，來探討這三種腫瘤標(biāo)記物對鼻咽癌早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷的臨床應(yīng)用價值。1資料與方法1.1研究對象選擇2008年1月至2008年12月，初診在我院耳鼻喉科病理確診，接受根治性放療后又來我科跟蹤隨訪的鼻咽癌患者62例，其中男43例，女19例，年齡26-68歲，中位年齡48歲。放療后每3個月隨訪一次，隨訪截止時間為2009年6月，中位隨訪時間為6（1-15）個月。隨訪時對患者進(jìn)行常規(guī)體檢及間接鼻咽鏡檢查，對可疑腫瘤殘存或局部復(fù)發(fā)者行纖維鼻咽鏡活檢，可疑遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者加用其他檢查手段。再隨機(jī)選取健康體檢人員62例作為對照。1.2標(biāo)本采集分別抽取治療前（初診）、治療后（2-6W）鼻咽癌患者及健康對照組人員的清晨空腹肘靜脈血10ml，其中5ml放入普通試管中，另外5ml放入EDTA抗凝管中，離心分離得血清和血漿，置于-20凍存。1.3樣本DNA抽提與熒光定量PCR反應(yīng)凍存的血漿置于4解凍，每例標(biāo)本取50ul血漿，用QIAamp血液DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）抽提DNA。抽提方法按試劑盒說明書進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)測定血漿EBVDNA水平。EB病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒購買自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，包括DNA提取液、臨界陽性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、陽性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品以及PCR反應(yīng)管等。用上海楓林FTC-2000實時熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，檢測步驟、結(jié)果判斷以及質(zhì)量控制方法按廠家說明。1.4電化學(xué)發(fā)光法檢測血清CYFRA21-1含量采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清CYFRA21-1含量。儀器Elecsys1010全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，瑞士Roche公司產(chǎn)品，試劑盒由Roche公司提供。操作過程嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。1.5免疫酶法檢測血清VCA-IgA滴度用常規(guī)的免疫酶法檢測血清VCA-IgA滴度。1.6陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)血漿EBVDNA0copies/ml為陽性；血清CYFRA21-13.3ug/L為陽性；血清VCA-IgA滴度1：10為陽性。1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用（_xS）或中位數(shù)表示，樣本比較用u檢驗。2結(jié)果2.1血漿EBVDNA水平治療前組EBVDNA陽性率為95.16（59/62），中位拷貝數(shù)為94104copies/ml。治療后組EBVDNA陽性率為30.65（19/62），中位拷貝數(shù)為0copies/ml；在19例EBVDNA陽性患者中，有15例處于高拷貝狀態(tài)，在隨訪過程中發(fā)現(xiàn)9例腫瘤殘存或局部復(fù)發(fā)，6例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。另外，有2例EBVDNA陰性患者在隨訪過程中出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。健康對照組EBVDNA陽性率為6.45（4/62），中位拷貝數(shù)為0copies/ml。治療前組EBVDNA陽性率顯著高于健康對照組（u檢驗：u=9.87，P0.01，差異有高度顯著性）。血漿EBVDNA檢測結(jié)果見表1。表1血漿EBVDNA水平組別例數(shù)陽性人數(shù)（例）陽性率（）中位拷貝數(shù)（copies/ml）治療前組625995.1694104治療后組621930.650健康對照組6246.4502.2血清CYFRA21-1含量治療前組CYFRA21-1陽性率為58.06（36/62），含量為6.835.21ug/L。治療后組陽性率為14.52（9/64），含量為1.620.46ug/L，9例陽性病人在隨訪過程中有4例為腫瘤殘存或局部復(fù)發(fā)，有5例為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中有2例EBVDNA陰性。健康對照組陽性率為0，含量為1.320.23ug/L。治療前組CYFRA21-1陽性率顯著高于健康對照組（u檢驗：u=7.12，P0.01，差異有高度顯著性）。血清CYFRA21-1含量見表2。表2血清CYFRA21-1含量組別例數(shù)陽性人數(shù)（例）陽性率（）CYFRA21-1濃度(_xS，ug/L)治療前組623658.066.835.21治療后組62914.521.620.46健康對照組62001.320.232.3血清VCA-IgA滴度治療前組VCA-IgA陽性率為93.55（58/62），治療后組陽性率為74.19（46/62），健康對照組陽性率為35.48（22/62）。治療前組VCA-IgA陽性率顯著高于健康對照組（u檢驗：u=6.67，P0.01，差異有高度顯著性）。血清VCA-IgA陽性率比較見表3；滴度比較見表4。表3血清VCA-IgA陽性率比較組別例數(shù)陽性人數(shù)（例）陽性率（）治療前組625893.55治療后組624674.19健康對照組622235.48表4血清VCA-IgA滴度比較滴度分級治療前組（例）治療后組（例）健康對照組（例）陰性1：1041640低滴度1：10-1：20113119中滴度1：40-1:160高滴度1:1603710963062例初診鼻咽癌患者血清VCA-IgA滴度除4例陰性11例處于低滴度外，余47例均1：40；治療后組中腫瘤殘存或局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者除2例VCA-IgA處于低滴度外，有15例處于中高滴度狀態(tài)；健康對照組除3例處于中高滴度狀態(tài)外，余均1：20。3討論鼻咽癌在我國華南地區(qū)相對高發(fā)，與EB病毒密切相關(guān)。在鼻咽癌的發(fā)展過程中，EB病毒感染和多種體細(xì)胞遺傳和表觀遺傳變化協(xié)同地破壞正常細(xì)胞功能，引起鼻咽癌的發(fā)生3。鼻咽癌具有特殊的臨床病理特征，包括對放療異常敏感，容易出現(xiàn)腫瘤殘存、局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前鼻咽癌患者療效的監(jiān)測主要依據(jù)鼻咽鏡和影像學(xué)檢查，但對放療后腫瘤侵潤與纖維化的鑒別、殘存腫瘤性質(zhì)的判斷以及較小轉(zhuǎn)移灶的診斷等方面具有一定的局限性1。因此，探索能監(jiān)測鼻咽癌患者療效的相關(guān)腫瘤標(biāo)記物顯得十分必要。腫瘤標(biāo)記物是指標(biāo)示腫瘤存在的一些生物化學(xué)物質(zhì)，從臨床應(yīng)用角度出發(fā)，它們主要指那些在血漿或其他體液中可以檢測到的有關(guān)物質(zhì)4。近年來，有研究者在腫瘤患者血漿和血清中發(fā)現(xiàn)腫瘤源性DNA存在5，血漿中的腫瘤源性DNA可能是腫瘤細(xì)胞死亡的標(biāo)志6。Lo等7首次報道應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)在96的鼻咽癌患者和7的正常對照者血漿中檢測到EBVDNA，同時發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血漿EBVDNA平均拷貝數(shù)明顯高于正常對照陽性者，得出鼻咽癌患者血漿EBVDNA平均拷貝數(shù)與患者病情有一定相關(guān)性的初步結(jié)論。本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析鼻咽癌患者治療前與治療后血漿EBVDNA含量，并結(jié)合臨床檢查和相關(guān)影像學(xué)檢查跟蹤隨訪患者預(yù)后情況，發(fā)現(xiàn)治療后組19例EBVDNA陽性患者中，有15例處于高拷貝狀態(tài)，在以后的隨訪中有9例出現(xiàn)腫瘤殘存或局部復(fù)發(fā)，有6例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，說明臨床上可以通過檢測血漿EBVDNA含量來及時監(jiān)測治療后鼻咽癌患者的腫瘤殘存或復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，這對判斷鼻咽癌患者的療效和預(yù)后有重要的臨床意義。本組資料還顯示治療前患者EBVDNA陽性率（95.16）與健康對照組陽性率（6.45）相比較有高度顯著性差異，說明檢測血漿EBVDNA含量，對鼻咽癌的早期診斷和對高危人群的篩查有一定的臨床價值。血清CYFRA21-1是指細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段（CK19)，它廣泛分布在正常組織表面和鱗狀上皮中，正常狀態(tài)以寡聚物形式存在，含量極低，當(dāng)細(xì)胞惡變時，激活的蛋白酶加速了細(xì)胞的降解，使得大量細(xì)胞角質(zhì)蛋白片段釋放入血8。鼻咽癌大多起源于鼻咽部的被覆鱗狀上皮，檢測血清CYFRA21-1含量將有助于鼻咽癌的診斷。本研究應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清CYFRA21-1含量，發(fā)現(xiàn)初診鼻咽癌患者血清CYFRA21-1陽性率（58.06）與健康對照組陽性率（0）相比較有高度顯著性差異，這與其他文獻(xiàn)報道相近9、10，說明血清CYFRA21-1的檢測對鼻咽癌的診斷有一定的臨床價值。但由于相關(guān)上皮起源的腫瘤均可表達(dá)CK19，因此CYFRA21-1對器官的特異性不甚理想11。本組資料還提示，治療后組有9例血清CYFRA21-1陽性，在以后的隨訪過程中，有4例出現(xiàn)腫瘤殘存或復(fù)發(fā)，有5例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中2例為EBVDNA陰性，說明檢測血清CYFRA21-1濃度對判斷鼻咽癌患者的預(yù)后亦有一定的臨床意義，且與血漿EBVDNA的檢測有互補(bǔ)作用。血清VCA-IgA滴度檢測，作為特異鼻咽癌腫瘤標(biāo)記物在臨床上已得到廣泛應(yīng)用。本研究顯示初診鼻咽癌患者血清VCA-IgA陽性率（93.55）較健康對照組（35.48）有高度顯著性差異，進(jìn)一步證實其診斷價值。從表4還可以看出治療后有腫瘤殘存、復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，血清VCA-IgA滴度大多數(shù)處于中高滴度狀態(tài)，說明檢測血清VCA-IgA滴度有助于鼻咽癌患者的預(yù)后判斷。因此，我們認(rèn)為同時檢測外周血中EBVDNA含量、CYFRA21-1濃度和VCA-IgA滴度，有助于鼻咽癌的早期診斷和對高危人群的篩查，且對鼻咽癌患者的療效監(jiān)測和預(yù)后判斷有重要的臨床意義。另外，血液學(xué)檢查具有操作簡便、費(fèi)用低、痛苦少等特點(diǎn)，患者易于接受。當(dāng)然，為進(jìn)一步明確其作為腫瘤標(biāo)記物的敏感性和特異性，今后尚需開展大樣本動態(tài)觀察。參考文獻(xiàn)：1李多杰，彭開桂，江浩，等.血漿EBVDNA定量分析在監(jiān)測鼻咽癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的價值J.實用腫瘤雜志.2008，23（1）：12-15.2田勇泉.耳鼻咽喉科學(xué)M.第五版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：147-149.3馮海燕，莫穎禧，周曉瑩，等.鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA水平與腫瘤的分期關(guān)系J.臨床耳鼻喉頭頸外科雜志，2008，22（6）：277-278.4吉彬，吉軍.電化學(xué)發(fā)光CYFRA21-1檢測在鼻咽癌臨床診斷中的價值J.海南醫(yī)學(xué)，2007，18（02）：63.5HibiK,RobinsonR,BookerS,etal.MoleculardetectionofgeneticalterationsintheserumofcolorectalcancerpatientsJ.CancerRes,1998,58(7):1045-1047.6Four