課題3　血紅蛋白的提取和分離

庖丁巧解牛知識(shí)巧學(xué) 一、凝膠色譜法凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，通過(guò)的路程短，移動(dòng)速度快；相對(duì)分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道，通過(guò)的路程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢。因此，樣品中相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)先流出，相對(duì)分子質(zhì)量小的分子后流出。二、緩沖溶液緩沖溶液能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持溶液pH基本不變。該溶液的這種抗pH變化的作用稱(chēng)為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內(nèi)所溶解的溶質(zhì)（化合物）稱(chēng)之為緩沖劑，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比即可制得在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。知識(shí)拓展 緩沖溶液由足夠濃度的酸堿對(duì)組成。其中，能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)堿的稱(chēng)為共軛酸，能對(duì)抗外來(lái)強(qiáng)酸的稱(chēng)為共軛堿，這一對(duì)共軛酸堿通常稱(chēng)為緩沖對(duì)、緩沖劑或緩沖系，常見(jiàn)的緩沖對(duì)主要有三種類(lèi)型：弱酸及其對(duì)應(yīng)的鹽；多元弱酸的酸式鹽及其對(duì)應(yīng)的次級(jí)鹽；弱堿及其對(duì)應(yīng)的鹽。三、電泳電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的的。要點(diǎn)提示 電泳分離方法主要就是根據(jù)大分子的分子量及電性差異將大分子在電場(chǎng)中彼此分來(lái)的。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這些帶電粒子在電泳時(shí)的遷移率，與粒子所帶的電荷量成正比，與分子量大小成反比。四、實(shí)驗(yàn)操作：蛋白質(zhì)的提取和分離1.樣品處理（1）紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白。采用低速短時(shí)間離心，吸出上層透明的黃色液體，再加入五倍體積的生理鹽水，重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。要點(diǎn)提示 洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法去除血漿蛋白；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)高會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。（2）血紅蛋白的釋放紅細(xì)胞在蒸餾水和40%的甲苯作用下破裂，釋放血紅蛋白。（3）分離血紅蛋白溶液將混合液進(jìn)行離心后會(huì)分層，第3層的紅色透明液體是血紅蛋白。（4）透析目的是除去樣品中的分子量較小的雜質(zhì)。2.凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作（2）凝膠色譜柱的裝填裝填前，凝膠用蒸餾水或者洗脫液充分溶脹。凝膠裝填要均勻，色譜柱內(nèi)不能有氣泡，一旦發(fā)現(xiàn)有，必須重裝。裝填完后，立即用300 ml 20 mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密。（3）樣品的加入和洗脫按正確方法加樣，不能破壞凝膠面。進(jìn)行洗脫時(shí)，等紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，采用試管收集。方法點(diǎn)撥 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌和紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。疑點(diǎn)突破 血紅蛋白的分離是否成功如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話(huà)，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(選做)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量,是根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陽(yáng)離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結(jié)合成復(fù)合物,使蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng),使蛋白質(zhì)分子相對(duì)遷移率的大小完全取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)和相對(duì)遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中求出供試品的分子量。問(wèn)題探究 問(wèn)題1 凝膠色譜柱的裝填應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？思路:凝膠色譜柱的高度、平整程度以及均勻與否都可能會(huì)影響樣品的分離度。探究:（1）裝填前為了加速膨脹，可以加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)約時(shí)間，除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)空氣。（2）裝填時(shí)不能有氣泡，氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。（3）裝填后不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。問(wèn)題2 蛋白質(zhì)是如何分離的？思路:蛋白質(zhì)是根據(jù)離心原理分離的。探究:當(dāng)含有細(xì)小顆粒的懸浮液靜置不動(dòng)時(shí)，由于重力場(chǎng)的作用，使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會(huì)上浮。微粒在重力場(chǎng)下移動(dòng)的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且又與重力場(chǎng)的強(qiáng)度及液體的粘度有關(guān)。象紅血球大小的顆粒，直徑為數(shù)微米，就可以在通常重力作用下觀(guān)察到它們的沉降過(guò)程。典題熱題例1下列關(guān)于凝膠色譜法的原理及操作不正確的是（）A.是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開(kāi)的一種方法B.在洗脫過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而最先流出，而小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部而流速緩慢，以致最后流出C.凝膠內(nèi)部有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其孔隙大小與被分離的物質(zhì)分子的大小無(wú)相應(yīng)關(guān)系D.一般情況下，凝膠對(duì)要分離的物質(zhì)沒(méi)有吸附作用，因此所有要分離的物質(zhì)都應(yīng)該被洗脫出來(lái)。解析：本題考查凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理。凝膠色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)的有效方法，凝膠是由多糖類(lèi)化合物構(gòu)成的，其內(nèi)部有很微細(xì)的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子蛋白質(zhì)可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部，路程較短，移動(dòng)速度快，因此在洗脫過(guò)程中分離。選用不同種凝膠，其立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不同，孔隙大小不同，因此可分離的分子大小也不同，故應(yīng)相關(guān)。凝膠一般對(duì)分離的物質(zhì)無(wú)吸附作用，所有要分離的物質(zhì)都應(yīng)該被洗脫出來(lái)。這是凝膠色譜法與一般層析法的不同。答案：C例2電泳技術(shù)可分離和解析氨基酸和核苷酸等有機(jī)物，下圖是把含有21個(gè)氨基酸的多肽進(jìn)行水解，將氨基酸混合物進(jìn)行電泳的結(jié)果。據(jù)圖分析該多肽由幾種氨基酸組成（）A.6 B.4C.5 D.3解析：電泳分離方法主要就是