FGF與Wnt通路.docx

在軟骨FGFR信號傳遞試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，成纖維生長因子及經(jīng)典Wnt/聯(lián)蛋白信號傳遞協(xié)同抑制軟骨細(xì)胞分化ABSTRACT在骨骼發(fā)育不良中，異常的成纖維生長因子（FGF）信號傳遞干擾了軟骨細(xì)胞分化，但其背后的機(jī)制仍不清楚。最近，人們發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中FGF通過Erk MAP激酶介導(dǎo)WNT共受體Lrp6磷酸化，從而激活了經(jīng)典WNT/聯(lián)蛋白途徑。本文中，我們探索了這種信號傳遞相互作用對細(xì)胞產(chǎn)生的作用。在小鼠肢芽微團(tuán)塊及肢體器官培養(yǎng)中，WNT增強(qiáng)了FGF介導(dǎo)的對軟骨細(xì)胞分化的抑制，使得微團(tuán)塊培養(yǎng)中軟骨結(jié)節(jié)的形成受到抑制，并且被培養(yǎng)的肢體生長受到抑制。FGF和WNT/聯(lián)蛋白途徑同時(shí)激活引起軟骨細(xì)胞外基質(zhì)丟失，礦化組織特異性基因表達(dá)，細(xì)胞形狀改變。WNT通過抑制基質(zhì)合成并誘導(dǎo)生成涉及基質(zhì)降解的那些蛋白激酶，從而增強(qiáng)了FGF對軟骨細(xì)胞蛋白多糖和膠原性細(xì)胞外基質(zhì)的下調(diào)。FGF與WNT協(xié)同誘導(dǎo)了調(diào)控RhoA GTPase通路的那些基因表達(dá)，而RhoA信號傳遞的抑制緩解了由FGF/WNT介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞形狀的變化。我們的結(jié)果提示異常的FGF信號傳遞與WNT/聯(lián)蛋白協(xié)同抑制了軟骨細(xì)胞的分化。INTRODUCTION軟骨內(nèi)骨化，即先前的軟骨被骨質(zhì)替換掉，是骨縱向生長的主要機(jī)制。骨在骺生長板處變得更長，而生長板處的軟骨細(xì)胞經(jīng)歷了一系列分化階段。軟骨細(xì)胞離開其靜息狀態(tài)，呈柱狀排列增殖，推出細(xì)胞周期并變得肥大，在這個(gè)過程中它們使其基質(zhì)礦化，并開始凋亡。然后軟骨就被骨質(zhì)替換掉了（1）。FGF信號傳遞是這一過程的主要調(diào)控者之一。在小鼠中移除FGFR3會造成骨骼過度生長（2），而人類中FGFR3的活化突變與一些骨骼發(fā)育不良疾病有關(guān)，比如最常見的短肢侏儒癥軟骨發(fā)育不全（ACH），以及致死性發(fā)育不良（TD），它是最常見的致死性骨骼發(fā)育不良病。FGFR3相關(guān)性骨骼發(fā)育不良的標(biāo)志性特征之一就是生長板結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重破壞，在TD中，這種破壞造成肥大軟骨細(xì)胞柱變小，或根本就不存在（4）。這揭示了異常的FGF信號傳遞在軟骨分化過程中的負(fù)性作用，但這種表型背后的機(jī)制仍不清楚。其中一個(gè)解釋是FGFR3可能干擾了Indian Hedgehog（Ihh）/甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）信號傳遞，該信號傳遞對軟骨細(xì)胞正確地從增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)向肥大狀態(tài)是必須的（5）。ACH和TD的小鼠模型的生長板中，都顯示出Ihh和PTHrP信號傳遞成分表達(dá)受到抑制，而向培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中加入PTHrP可以部分對抗由FGFR3調(diào)控的細(xì)胞表型（69）。我們認(rèn)為，對于在TD中觀察到的所有類型的軟骨細(xì)胞分化缺陷，Ihh/PTHrP信號傳遞受損不是其唯一原因。其它可能介導(dǎo)FGFR3對軟骨細(xì)胞分化作用的機(jī)制仍然有待描述，這妨礙了我們對FGFR3在骨骼生長中功能的完整理解。最近，我們描述了軟骨細(xì)胞中經(jīng)典（即依賴于聯(lián)蛋白的）WNT途徑受FGF信號傳遞而激活，證據(jù)是FGF介導(dǎo)聯(lián)蛋白穩(wěn)定化，其在細(xì)胞核中聚集程度增加，以及聯(lián)蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄過程的活化。這一表型依賴于4個(gè)胞內(nèi)PPPS/TP模體上Erk MAP激酶介導(dǎo)的WNT共受體Lrp6磷酸化，這4個(gè)模體是WNT/聯(lián)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必須的（10，11）。此外，F(xiàn)GFR3突變還與骨骼發(fā)育不良有關(guān)，表現(xiàn)出通過Erk/Lrp6途徑的信號傳遞增加（12）。有趣的是，經(jīng)典WNT配體出現(xiàn)在生長板軟骨中，而其中WNT/聯(lián)蛋白途徑的生理活化，通過抑制PTHrP信號傳遞并誘導(dǎo)終末分化軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)志基因，促進(jìn)了軟骨細(xì)胞分化（12，14）。目前這項(xiàng)研究旨在探索FGF與WNT/聯(lián)蛋白信號傳遞之間的相互作用，對軟骨細(xì)胞分化調(diào)控所產(chǎn)生的影響。RESULTS AND DISCUSSION軟骨細(xì)胞中FGF激活了WNT/聯(lián)蛋白信號傳遞小鼠軟骨瘤軟骨細(xì)胞（RCS）是一種永生化的，表型穩(wěn)定的細(xì)胞系，表達(dá)FGFR2和FGFR3，但不表達(dá)FGFR1和FGFR4，并產(chǎn)生大量的軟骨樣胞外基質(zhì)（ECM），這種基質(zhì)由硫酸蛋白多糖和型膠原組成（1517）。通過添加外源性FGF2，活化RCS細(xì)胞中的FGFR信號傳遞，引起Lrp6在Ser1490和Thr1572處磷酸化（Fig.1A）（10），伴有聯(lián)蛋白累積，持續(xù)時(shí)間長達(dá)5天（Fig.1B）。我們在另外兩個(gè)軟骨發(fā)育模型中檢測了FGF2介導(dǎo)的Lrp6磷酸化，這兩個(gè)模型一個(gè)是E12小鼠肢芽間質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)，通過微團(tuán)塊培養(yǎng)誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化（18，19），另一個(gè)是從E17.5胚胎中游離的小鼠股骨肢體器官培養(yǎng)。這兩個(gè)模型都對FGF2處理有反應(yīng)，Lrp6磷酸化（Fig.1A）。Ser1490和Thr1572屬于Lrp6上的PPPS/TP模體，該模體充當(dāng)接納位點(diǎn)，從聯(lián)蛋白破壞復(fù)合物中隔絕掉Axin1和GSK3，使聯(lián)蛋白穩(wěn)定化并使轉(zhuǎn)錄活化（20）。移除PPPS/TP模體損傷WNT信號傳遞，而通過獨(dú)立于WNT/聯(lián)蛋白途徑的激酶，比如說Erk MAPK，在PPPS/TP模體中磷酸化，會促進(jìn)WNT信號傳遞（21，22）。在RCS軟骨細(xì)胞中，F(xiàn)GF2介導(dǎo)的Lrp6磷酸化，使細(xì)胞在分子上對WNT3a（經(jīng)典WNT配體）的反應(yīng)增加了100多倍（10）。為了識別FGF2與WNT3a相互作用背后的潛在感受因子，我們利用多種熒光酶指示基因（reporter）來確定FGF2和WNT3a對已知調(diào)控軟骨細(xì)胞行為的關(guān)鍵信號傳遞途徑的轉(zhuǎn)錄活性所產(chǎn)生的影響，比如NF-kB，Snail，Elk1（Erk MAPK活性的指示劑），Sox9，Tgf以及Ihh（11，2327）。FGF2和WNT3a調(diào)控了所有受測指示基因的活性（Fig.1C）。但是，這些變化與FGF2和WNT3a共同刺激所誘導(dǎo)的大規(guī)模聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性（Topflash reporter）相比很小，提示在FGF和WNT信號傳遞相互作用中聯(lián)蛋白是主要的感受因子。在小鼠肢芽微團(tuán)塊培養(yǎng)和肢體器官培養(yǎng)中，F(xiàn)GF2和WNT3a協(xié)同作用抑制了軟骨細(xì)胞分化確定了RCS軟骨細(xì)胞中FGF和WNT/聯(lián)蛋白信號途徑的相互作用后，我們探索了FGF2和WNT3a處理對取自E12小鼠肢芽的間質(zhì)微團(tuán)塊培養(yǎng)物產(chǎn)生的作用。這一模型概括了離體條件下軟骨細(xì)胞的分化，其在培養(yǎng)的第7天可以觀察到軟骨結(jié)節(jié)形成，在14天可以觀察到ECM礦化（28）（Fig.2A,B）。生長了14天的微團(tuán)塊中觀察到的基質(zhì)礦化可能起源自間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，或源自肥大軟骨細(xì)胞分化。由于替代的是軟骨結(jié)節(jié)的外面而不是里面，所以很可能礦化基質(zhì)是由新分化的成骨細(xì)胞產(chǎn)生的，而不是由肥大軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的（Fig.2B，右側(cè)部分）。通過對增殖軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)志基因（型膠原），肥大軟骨細(xì)胞特異性標(biāo)志基因（型膠原），以及成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志基因（runx2，骨鈣素）進(jìn)行定量RT-PCR分析，顯示出在第14天時(shí)軟骨細(xì)胞標(biāo)志物部分下降，伴runx2和骨鈣素mRNA大量上調(diào)，從而證實(shí)了上述觀點(diǎn)（Fig.S1）。單獨(dú)使用時(shí)，在微團(tuán)塊培養(yǎng)中FGF2和WNT3a都可以抑制軟骨細(xì)胞分化，其證據(jù)是培養(yǎng)7天后軟骨細(xì)胞結(jié)節(jié)的數(shù)量和大小都減少。在受到FGF2和WNT3a同時(shí)處理的細(xì)胞中這種表型最顯著（Fig.2A）。與之相比，培養(yǎng)14天時(shí)，F(xiàn)GF2和WNT3a增加了基質(zhì)礦化，聯(lián)用這兩種生長因子時(shí)在培養(yǎng)物中觀察到礦化效應(yīng)最強(qiáng)（Fig.2B）。因此，F(xiàn)GF似乎與WNT/聯(lián)蛋白信號傳遞協(xié)同作用抑制微團(tuán)塊培養(yǎng)中的軟骨細(xì)胞分化，同時(shí)增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化（Fig.2C）。與RCS軟骨細(xì)胞中或肢芽微團(tuán)塊培養(yǎng)中的情況一樣，在E17.5小鼠股骨中新鮮識別出了（freshly isolated）由FGF2啟動的Lrp6磷酸化（Fig.1A）。我們使用肢體器官培養(yǎng)來測試FGF和WNT/聯(lián)蛋白信號傳遞之間的相互作用是否會影響生長板軟骨中軟骨細(xì)胞的行為。從E18小鼠胚胎中游離出的脛骨表現(xiàn)出正常的生長板結(jié)構(gòu)，增殖狀態(tài)和分化狀態(tài)的軟骨細(xì)胞有不同的區(qū)域，包括位于軟骨-骨連接處的終末分化軟骨細(xì)胞（數(shù)據(jù)未顯示）。這種脛骨用FGF2處理8天，與對照組相比其生長板顯著縮短，結(jié)構(gòu)上顯著無組織，其證據(jù)是肥大區(qū)減少伴柱狀軟骨細(xì)胞缺如（Fig.3A,B）。經(jīng)FGF2處理的脛骨中型膠原減少，證實(shí)了這一點(diǎn)（Fig.3C）。單獨(dú)用WNT3a處理的脛骨，與用FGF2/WNT3a處理的脛骨相比，生長正常，后者表現(xiàn)出最為顯著的生長抑制，同時(shí)表達(dá)型膠原的軟骨細(xì)胞幾乎完全消失。用非經(jīng)典（即獨(dú)立于聯(lián)蛋白的）WNT配體WNT5a處理的脛骨中未發(fā)現(xiàn)與FGF2介導(dǎo)的生長抑制相類似的效應(yīng)（Fig.S2）。與已發(fā)表的文獻(xiàn)一樣（29），這個(gè)現(xiàn)象揭示出FGF信號傳遞干擾了生長板中的肥大軟骨細(xì)胞分化。用WNT3a處理造成WNT/聯(lián)蛋白途徑活化增強(qiáng)了這一效應(yīng)。FGF2和WNT3a協(xié)同調(diào)控軟骨細(xì)胞形狀及ECM更替在RCS軟骨細(xì)胞中，F(xiàn)GFR的活化通過抑制基質(zhì)合成并激活蛋白水解，引起軟骨細(xì)胞硫酸蛋白多糖ECM迅速喪失（30，31）。如阿爾新藍(lán)染色所示，這種表型在經(jīng)FGF2/WNT3a處理的細(xì)胞中最明顯；WNT3a單用不會改變ECM的產(chǎn)生（Fig.4A）。通過使用35S硫酸鹽的代謝蛋白多糖標(biāo)記，更好地量化測定了硫酸蛋白多糖ECM（30），其結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)（Fig.4B）。除了蛋白多糖ECM，膠原ECM的產(chǎn)生也受到FGF信號傳遞的調(diào)控，其證據(jù)是經(jīng)FGF2處理后型膠原表達(dá)下降；這一效應(yīng)受WNT3a增強(qiáng)，細(xì)胞經(jīng)FGF2/WNT3a處理72小時(shí)后幾乎見不到型膠原的表達(dá)（Fig.4C）。在FGFR3相關(guān)性骨骼發(fā)育不良中，軟骨細(xì)胞形狀改變是一個(gè)關(guān)鍵的組織學(xué)特征（4）。在RCS軟骨細(xì)胞中也表現(xiàn)有相似的表型，經(jīng)FGF2處理的細(xì)胞增大，變平，通過鬼筆環(huán)肽（phalloidin）對肌動蛋白應(yīng)力纖維進(jìn)行染色，示細(xì)胞骨架也出現(xiàn)了重構(gòu)（Fig.5A,D）。通過對黏著斑的黏著蛋白染色，還主觀觀察到經(jīng)FGF2處理的軟骨細(xì)胞中底物黏附增加（Fig.5C）。盡管單用WNT3a對RCS細(xì)胞形狀沒有影響，但它增強(qiáng)了FGF2介導(dǎo)的細(xì)胞形狀變化，即與單用FGF2處理的細(xì)胞相比，細(xì)胞僅在一條軸上延長，而后者細(xì)胞向各個(gè)方向均質(zhì)性增長（Fig.5A）（supplemental movie 1）。通過測定細(xì)胞周長，我們量化了這類變化，細(xì)胞的大小增加，細(xì)胞邊界的復(fù)雜程度增加。Fig.5B的數(shù)據(jù)揭示出經(jīng)FGF2處理和經(jīng)FGF2/WNT3a處理的細(xì)胞，與未處理細(xì)胞相比，周長增加約1倍。細(xì)胞形狀上的區(qū)別，通過測定細(xì)胞“偏心距”的大小來量化，該參數(shù)反映了沿一條軸的延長程度。FGF2增加了細(xì)胞的偏心距，并且這種表型受WNT3a顯著增強(qiáng)，不過單用WNT3a時(shí)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形狀有變化。單用WNT5a或與FGF2聯(lián)用時(shí)均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形狀有變化（數(shù)據(jù)未顯示）。為了識別出FGF2和WNT3a調(diào)控的細(xì)胞表型所涉及的基因，我們對經(jīng)FGF2和/或WNT3a處理16或48小時(shí)后的RCS軟骨細(xì)胞做了表達(dá)分布分析，計(jì)算ECM上由FGF2/WNT3a介導(dǎo)的變化，細(xì)胞形狀需要至少48小時(shí)才能完全表現(xiàn)出來（30）（Supplementary Movie 1）?；虮磉_(dá)分布分析顯示W(wǎng)NT3a增強(qiáng)了FGF2對某些ECM關(guān)鍵成分表達(dá)的抑制作用（型膠原，型膠原，聚蛋白多糖，硫酸蛋白軟骨素4，軟骨中間層蛋白，軟骨黏附蛋白），涉及蛋白多糖生產(chǎn)的那些蛋白質(zhì)比如硫酸軟骨素合酶3也受到抑制（Table 1）。另外，WNT3a增強(qiáng)了FGF2介導(dǎo)的某些涉及ECM分解代謝的酶的誘導(dǎo)生成，比如說類肝素酶，以及屬于Adamts家族（一種解聚素和伴糖蛋白G模體的代謝蛋白酶）的一些蛋白酶。雖然FGF2增加了Adamts4和Adamts5的表達(dá)，這兩種是活體中聚蛋白多糖降解的主要蛋白酶（32），但WNT3a對這種效應(yīng)表現(xiàn)出的更多是抑制而非增長（Table 1）。因此與FGF2和WNT3a對軟骨細(xì)胞中蛋白多糖ECM降解的協(xié)同作用有關(guān)的可能是其它蛋白酶。有趣的是，WNT3a顯著增強(qiáng)了FGF2介導(dǎo)的對Adamts1，Adamts6和Adamts7表達(dá)的誘導(dǎo)，這三者都可以降解聚蛋白多糖（33，34）。FGF2和WNT3a也協(xié)同作用調(diào)控RCS細(xì)胞形態(tài)（Fig.5）。FGF2和WNT3a增強(qiáng)了某些基因的表達(dá)，這些基因涉及細(xì)胞骨架重構(gòu)（肌動蛋白結(jié)合LIM蛋白1，腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白1（drebrin 1），細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)成分（GRINL1A聯(lián)合蛋白，角蛋白家族成員，高硫黃蛋白B2F），以及細(xì)胞粘附分子（整合蛋白4，整合蛋白7，鈣黏著蛋白19，原鈣黏著蛋白家族成員）（Table 1）。重要的是，F(xiàn)GF2和WNT3a還調(diào)控編碼某些蛋白質(zhì)的六種基因的表達(dá)，這些蛋白質(zhì)參與GTP酶Rho家族信號傳遞。這些蛋白質(zhì)包括RhoA抑制劑Arhgap18，Srgap3，RhoA激活劑Fgd3和Fgd6，以及RhoE GTP酶（3538）。RhoA，Rac1和Cdc2是GTP酶Rho家族的經(jīng)典成員，在細(xì)胞黏附，細(xì)胞形狀變化，以及細(xì)胞遷移期間調(diào)控細(xì)胞骨架重構(gòu)。雖然這三種蛋白質(zhì)都調(diào)控肌動蛋白細(xì)胞骨架，但它們調(diào)控的本質(zhì)是不同的。Cdc42和Rac1誘導(dǎo)細(xì)胞遷移所需要的層形足板（lamellipodia）和絲狀偽足（filopodia），而RhoA的活化調(diào)控肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成，以及繼發(fā)的細(xì)胞形態(tài)變化（39）。在經(jīng)FGF2和/或WNT3a處理過的軟骨細(xì)胞中，我們沒有觀察到層形足板和/或絲狀偽足形成（Supplementary movie 1），提示在FGF2介導(dǎo)的RCS軟骨細(xì)胞形態(tài)變化中，Cdc42和Rac1沒有參與。有趣的是，黏著斑的形成需要RhoA，在黏著斑處諸如纖維連接蛋白這樣的ECM成分，通過整合蛋白，與肌動蛋白細(xì)胞骨架相互作用（40，41）。有趣的是，F(xiàn)GF2和WNT3a似乎能增加RCS細(xì)胞黏著斑的數(shù)量，不過我們沒有精確量化這一表型（Fig.5C）。之前我們報(bào)道過FGF2處理RCS軟骨細(xì)胞，誘導(dǎo)纖維連接蛋白強(qiáng)烈的增加（30）?？偟膩碚f，肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成，細(xì)胞形態(tài)的變化，以及層形足板或絲狀偽足形成的缺失，指出了在RCS軟骨細(xì)胞中，RhoA是受FGF和WNT/聯(lián)蛋白信號傳遞調(diào)控的主要的Rho GTP酶。我們對RhoA途徑進(jìn)行了化學(xué)抑制，評估其對FGF2和WNT3a介導(dǎo)的細(xì)胞形狀變化所產(chǎn)生的影響，從而檢驗(yàn)我們的假設(shè)。主要的RhoA信號傳遞中介物，p160ROCK激酶，被兩種不相關(guān)的化學(xué)抑制劑HA1100和Y27632抑制（42，43）。這兩種化合物都緩解了由FGF2/WNT3a誘導(dǎo)的RCS細(xì)胞形狀改變。在未經(jīng)FGF2處理（FGF2-naive）的細(xì)胞中，這兩種抑制劑的使用均沒有產(chǎn)生可以觀察到的細(xì)胞形態(tài)或增殖方面的影響（Fig.6A）。另外，在對照組或WNT3a處理組細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染C末端帶有GFP標(biāo)記的顯性失活（T19N）RhoA突變，沒有明顯改變細(xì)胞的形狀，但對FGF2和FGF2/WNT3a介導(dǎo)的RCS細(xì)胞形狀變化都有一定的緩解作用（Fig.6B，S3）。FGF2和WNT3a抑制軟骨細(xì)胞分化狀態(tài)與間質(zhì)起源的大部分組織相比，軟骨中FGF信號傳遞啟動的是反常的變化。人們已經(jīng)清楚，定義FGFR3相關(guān)性骨骼發(fā)育不良分子病理特點(diǎn)的主要細(xì)胞表型（即軟骨細(xì)胞生長靜息，ECM喪失，以及分化受到阻礙），僅僅是FGF信號傳遞誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞行為復(fù)雜變化中的一部分。在FGFR慢性活化條件下，軟骨細(xì)胞開始喪失它們已經(jīng)分化的狀態(tài)，這種特性是硫酸蛋白多糖和型膠原的大量產(chǎn)生。同時(shí)，間質(zhì)標(biāo)志物，比如型和型膠原，纖維連接蛋白，平滑肌肌動蛋白和S100a4，在細(xì)胞形態(tài)變得類似于未分化間質(zhì)細(xì)胞的同時(shí)也一起出現(xiàn)。在礦化組織中出現(xiàn)的那些典型基因（型膠原，Ctgf，骨調(diào)節(jié)蛋白（osteomodulin），骨鈣素，骨糖素（osteoglycin），骨活化蛋白（osteoactivin），在RCS軟骨細(xì)胞和一些離體與活體軟骨細(xì)胞模型中表達(dá)（Table 1）（16，30，4452）?？偠灾?，這個(gè)證據(jù)提示FGF信號傳遞抑制了軟骨細(xì)胞分化狀態(tài)，同時(shí)迫使細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞樣表型（Fig.7）。尚不清楚上述變化是全部源自對FGFR3活化的直接轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，還是涉及到其它通路。在這方面，RhoA通路受FGF2和FGF2/WNT3a活化，可能除了引起肌動蛋白細(xì)