泛素化蛋白檢測(cè)方法.doc

泛素化蛋白檢測(cè)方法l 蛋白質(zhì)泛素化簡(jiǎn)介蛋白質(zhì)泛素化修飾過程在人體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程中起到了關(guān)鍵性的作用。與磷酸化修飾過程一樣，泛素化修飾過程也是一種可逆的共價(jià)修飾過程，它能夠調(diào)節(jié)被修飾蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)定位等情況。泛素蛋白是一個(gè)由76個(gè)氨基酸殘基組成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反應(yīng)催化下與細(xì)胞內(nèi)靶蛋白上的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基發(fā)生共價(jià)連接。泛素蛋白本身也含有7個(gè)賴氨酸殘基，因此它們之間也可以通過這些位點(diǎn)互相連接，形成多泛素蛋白鏈（polyubiquitin chain）。目前研究顯示，如果多泛素蛋白鏈與被修飾蛋白上的第48位賴氨酸殘基相連，會(huì)介導(dǎo)靶蛋白進(jìn)入蛋白酶體而被降解；如果與被修飾蛋白上其它位點(diǎn)，比如第63位賴氨酸殘基相連，則靶蛋白可以發(fā)揮信號(hào)通路功能而不會(huì)被降解。與磷酸化修飾途徑一樣，泛素化修飾途徑也是可逆的，即可以通過去泛素化酶（DUB）將泛素蛋白修飾物去除掉。靶蛋白經(jīng)泛素化途徑修飾之后，連接在靶蛋白上的泛素蛋白單體或多聚體可以被各種泛素蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（UBD）所識(shí)別和結(jié)合。人類蛋白質(zhì)組中含有兩種E1酶、50種E2酶、600種E3酶、90種DUB酶和20種UBD，這說明泛素修飾途徑在細(xì)胞調(diào)控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修飾途徑中決定底物特異性的關(guān)鍵酶，它可以分為兩大類，即含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3酶和其它含有RING結(jié)構(gòu)域或RING樣結(jié)構(gòu)域（比如U-box或PHD結(jié)構(gòu)域）的E3酶。這兩種E3酶都在免疫調(diào)控過程中起到了關(guān)鍵性的作用。l 蛋白質(zhì)泛素化的檢測(cè)方法研究蛋白質(zhì)的泛素化首先需要明確的三個(gè)基本點(diǎn)：哪些蛋白發(fā)生了泛素化；發(fā)生了泛素化的蛋白質(zhì)，具體是哪個(gè)位點(diǎn)的賴氨酸殘基發(fā)生了泛素化；進(jìn)行定量。明確了上述幾點(diǎn)后，進(jìn)一步需要弄清楚的是，我們感興趣的泛素化蛋白，是如何發(fā)生泛素化的，影響這一泛素化過程的關(guān)鍵分子是什么？或者說這一過程中的E3酶是什么？然后需要研究的是，這一蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化之后可以產(chǎn)生那些分子效應(yīng)？對(duì)下游的信號(hào)通路有什么影響？研究上述內(nèi)容的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)流程：方法一：western blot and strip通過WB檢測(cè)所有發(fā)生泛素化的蛋白條帶，拍照后，將膜strip。然后與特定蛋白的抗體和特定泛素化位點(diǎn)的抗體反應(yīng)，顯色拍照。通過陽(yáng)性條帶的對(duì)比來初步判斷某一特定蛋白的特定位點(diǎn)發(fā)生了泛素化?！揪唧w實(shí)驗(yàn)流程附后】方法二：western blot and immunoprecipitations 通過免疫共沉淀方法將某一特定蛋白以及與其結(jié)合的蛋白分離出來。分離出來的蛋白再進(jìn)行SDS電泳和western blot分析。【具體實(shí)驗(yàn)流程附后】。這一方法可以明確具體哪個(gè)蛋白的哪個(gè)賴氨酸殘基發(fā)生了泛素化修飾。方法三：in vitro ubiquitination assay將要研究的目的基因轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，使其大量表達(dá)。24h后提取并分離目的蛋白。在體外反應(yīng)buffer中將我們要研究的蛋白A（被泛素化的那個(gè)蛋白）與UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin以及我們要研究的蛋白B（引起蛋白A泛素化的蛋白），共同進(jìn)行孵育。將孵育后的產(chǎn)物進(jìn)行IP和WB分析?！揪唧w實(shí)驗(yàn)流程附后】。這一方法可以明確引起哪個(gè)蛋白是引起某蛋白發(fā)生泛素化修飾的E3連接酶。方法四：in vitro ubiquitin-binding assay將我們要研究的蛋白（被泛素化的蛋白）基因轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，大量表達(dá)后提純?；蛘咧苯犹崛?nèi)源性蛋白。在體外與K63- or K48-linked ubiquitin chain petides孵育，然后通過SDS電泳并用泛素化抗體進(jìn)行檢測(cè)。這一方法可以明確要研究的蛋白哪個(gè)賴氨酸殘基容易發(fā)生泛素化。方法一：WB strip實(shí)驗(yàn)流程提取組織/細(xì)胞的總蛋白使用總泛素化抗體檢測(cè)所有發(fā)生了泛素化的蛋白（此時(shí)可以觀察到發(fā)生了泛素化的蛋白主要分布在哪些分子量區(qū)間）Stripping the blot用特定蛋白的抗體與膜反應(yīng)顯色用Ub K63抗體與膜反應(yīng)顯色Merge如果總的泛素化蛋白的條帶，與特定蛋白的條帶，以及K63位點(diǎn)泛素化條帶發(fā)生了重合，此時(shí)可以初步推測(cè)，特定蛋白的第63位賴氨酸殘基發(fā)生了泛素化方法二：Western blot and immunoprecipitations提取組織/細(xì)胞總蛋白用瓊脂糖珠或磁珠包被的特異蛋白抗體，將與該蛋白結(jié)合的所有蛋白分離出來SDS電泳用泛素化抗體進(jìn)行反應(yīng)Stripping the blot用特異抗體進(jìn)行反應(yīng)方法三：in vitro ubiquitination assay將要研究的蛋白基因轉(zhuǎn)染293細(xì)胞使其大量表達(dá)提取蛋白，通過免疫共沉淀方法分離目的蛋白將可能發(fā)生相互作用的兩種蛋白與UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin共同進(jìn)行孵育。使泛素