保健食品的微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證淺析

保健食品的微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證淺析,引言,隨著國(guó)民生活水平的提高，人們對(duì)生活的質(zhì)量也有了較高的要求，防病于未然的健康意識(shí)逐漸被人們所重視，保健食品隨之成為人們脫離亞健康的途徑之一。我國(guó)的保健食品概念是1996年保健食品管理辦法中的“標(biāo)明具有特定保健功能的食品。即適宜于特定人群食用，具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能，不以治療疾病為目的的食品”。具有三種屬性：食品屬性；功能屬性(具有特定的功能)；非藥品屬性。然而劣質(zhì)的保健食品不僅不能提高人們的生活質(zhì)量，甚至威脅生命安全，因而保健食品的安全評(píng)價(jià)及質(zhì)量檢驗(yàn)是保證人們使用合格產(chǎn)品的前提。,保健食品的質(zhì)量安全包括兩方面內(nèi)容：不以傳統(tǒng)食品為載體的保健食品具有其特有的安全問(wèn)題。以傳統(tǒng)食品為載體的，要考慮相應(yīng)的食品安全問(wèn)題，如以植物為來(lái)源的傳統(tǒng)食品當(dāng)考慮農(nóng)殘、植物生長(zhǎng)刺激素等；以動(dòng)物為來(lái)源則應(yīng)考慮抗生素、激素等。但同時(shí)作為保健食品特有的質(zhì)量安全問(wèn)題，還須高度關(guān)注保健食品中加入化學(xué)藥物（如違法添加芬氟拉明、麻黃素或速尿的減肥產(chǎn)品；又如某些“補(bǔ)品”檢出了枸櫞酸西地那非，即偉哥的主成分），各種功效成份/提取物內(nèi)源性毒物安全（如中草藥毒性及長(zhǎng)期服用安全性評(píng)價(jià)），新資源、新技術(shù)、功能性安全，進(jìn)口保健食品，偽劣保健食品，非法添加物的檢驗(yàn)等問(wèn)題。,鑒于保健食品于近年來(lái)暴露出的一些質(zhì)量問(wèn)題，中檢所和藥檢處統(tǒng)一部署，擴(kuò)大我所檢驗(yàn)范圍，開(kāi)展對(duì)保健食品的質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)工作，微生物限度作為食品藥品的必檢項(xiàng)目，顯示其基礎(chǔ)安全的重要性。我室于2005、06年進(jìn)行了保健食品衛(wèi)生微生物學(xué)限度檢驗(yàn)及方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)工作，完成了30多種購(gòu)買(mǎi)樣品的試檢驗(yàn)任務(wù)，以及幾個(gè)注冊(cè)品種的檢驗(yàn)，涉及口服液、片劑、膠囊、茶劑等常見(jiàn)保健食品類(lèi)型，結(jié)合食品國(guó)標(biāo)和藥典探討保健食品的檢驗(yàn)方法及可行性，現(xiàn)對(duì)有檢驗(yàn)情況匯報(bào)如下，供檢驗(yàn)部門(mén)參考。,摘 要,我所按中國(guó)藥典2005版微生物限度法及方法學(xué)驗(yàn)證法，對(duì)32種保健食品進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明其中15個(gè)品種（活謂素得而樂(lè)膠囊、忘不了3A腦營(yíng)養(yǎng)膠囊、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、華濟(jì)堂牌護(hù)肝靈膠囊、全蟲(chóng)草膠囊、再高鐵兒童成長(zhǎng)口服液、血爾口服液、瞳神牌輕亮、養(yǎng)顏鹿胎粉、夢(mèng)玉膠囊、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片、二月紅牌紅潤(rùn)片）分別對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有抑菌作用，染菌回收率均低于70%。結(jié)果說(shuō)明：1、采用GB/T4789.14789.31 2003食品微生物限度檢查法不能真實(shí)反應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量，因而不宜采用；2、應(yīng)分別采用培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過(guò)濾法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。 3、微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證的必要性。,關(guān)鍵詞,方法學(xué)驗(yàn)證、微生物限度、回收率、保健食品質(zhì)量。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?確認(rèn)對(duì)保健品進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，所采用的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查方法是否適合于該保健品的微生物限度檢查。,樣品,（1） 天元甘露低聚果糖液 20040701 云南綠色生物工程有限公司 （2） 維生素E（加州熊） 040902 濟(jì)南生命力生物科技有限公司 （3） 海王金樽 040712 深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司 （4） 神奇壽樂(lè)牌排鉛沖劑 040210 常州市紅太陽(yáng)工程有限公司 （5） 蓋中蓋高鈣片 20041207 哈藥集團(tuán)制藥六廠 （6） 龍希膳食纖維膠囊 20030718 湖北恩施宏業(yè)魔芋開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 （7） 紫薇卵磷脂膠囊 20041119 清華紫光（集團(tuán)）總公司 （8） 吾老七羊胎美容濃縮液 04092701 浙江蘅州市吾老七保健品有限公司 （9） 腦輕松膠囊 20041207 香港康富來(lái)國(guó)際企業(yè)有限公司 （10） 江中亮嗓胖大海 20040822 云南綠生物工程有限公司 （11） 江中活謂素得而樂(lè)膠囊 20041206 廣州藍(lán)鑰匙海洋生物工程有限公司 （12） 忘不了3A腦營(yíng)養(yǎng) 20041107 山東禹王制藥有限公司,（13） 瞳神牌輕亮 04030101 北京輕爾特科技開(kāi)發(fā)中心（14） 再高鐵兒童成長(zhǎng)膠囊 20040920 廣州市紅虹生物科技有限公司（15） 血爾口服液 20040006 香港康富來(lái)國(guó)際企業(yè)有限公司（16） 金舒通膠囊 20040601-05 武漢名實(shí)醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司（17） 仙牌靈芝茶 20050112 四川仙牌靈芝集團(tuán)有限公司（18） 事輕松膠囊 20041026 武漢靜悟綠色保健研究所（19） 養(yǎng)顏鹿胎粉 040606 廣東廣濟(jì)堂醫(yī)藥保健品有限公司（20） 老君舒壓茶 20041218 成都物華生物制品有限公司（21） 夢(mèng)玉膠囊 20050102 濟(jì)南生命生物科技有限公司（22）心態(tài)好（天一美樂(lè)寧片）031201 北京樂(lè)寧科技有限責(zé)任公司（23） 華濟(jì)堂牌護(hù)肝靈膠囊 20060517 美國(guó)德全高科技藥業(yè) 20060521 20060525,（24） 前烈立舒膠囊 QLS05222 香港奧美制藥廠（25） 二月紅牌紅潤(rùn)片 2007042425050 中天(上海)營(yíng)養(yǎng)食品有限公司（26） 紳寧寶膠囊 20050220、20050225香港康恩堂制藥有限公司（27） 博士倫博視康牌葉黃素片1515、1525、1535德國(guó)博士曼大藥廠（28） 全蟲(chóng)草膠囊 2006210 西藏天知生物科技開(kāi)發(fā)有限公司（29） 覺(jué)父膠囊 20050307、20050327 香港奧美制藥廠（30） 苦瓜精華素片 3117、3500 美國(guó)GSL科技有限公司（31） 寧烈寧膠囊 20050428、20050509 香港奧美制藥廠（32） 富威牌劍影膠囊 021333 北京富威生物科技開(kāi)發(fā)公司,二、培養(yǎng)基,膽鹽乳糖增菌液 批號(hào)：040324 玫瑰紅鈉瓊脂 批號(hào)：050316 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 批號(hào)：050310 營(yíng)養(yǎng)肉湯 批號(hào)：041010 改良馬丁瓊脂 批號(hào)：050520 改良馬丁瓊脂液體 批號(hào)：040302曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 批號(hào)：040413 葡萄糖肉浸液肉湯 批號(hào)：040902EMB 批號(hào)：040413 麥康凱 批號(hào)：050608 血營(yíng)養(yǎng)瓊脂 批號(hào)：050310 沙門(mén)、志賀菌屬瓊脂 批號(hào)：050121胰酪胨大豆肉湯 批號(hào)：050422 DHL 批號(hào)：0501274-甲基傘形酮葡萄糖苷(MUG) 050127 GN 批號(hào)：040224四硫酸鈉煌綠增菌液TTB 批號(hào)：040413 以上培養(yǎng)基均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，另由本室本室自行配制膽鹽乳糖增菌液（小倒管）10ml 。,三、 菌種,枯草桿菌(Bacillus subtilis) CMCC(B)63501、 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) CMCC(B) 26003、大腸埃希菌（Escherichia coli） CMCC(F) 44102、白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F) 98001、 黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F)98003 弗氏志賀菌（Shigella flexneri） CMCC(F)51573乙型溶血性鏈球菌（Hemolytic streptococcus） CMCC(F)32210沙門(mén)氏菌（Salmonella paratyphi）CMCC(B)50094,四、方法驗(yàn)證,1、菌液制備：（1）取經(jīng)37培養(yǎng)18-24小時(shí)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、乙型溶血性鏈球菌、福氏痢疾肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水10倍稀釋至10-5 10-7為50100CFU/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。（2）取經(jīng)25 培養(yǎng)1824小時(shí)的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml+9 ml鹽水10倍稀釋至10-5 為50100CFU/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。（3）取經(jīng)25 培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加35ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，與濁度相當(dāng)后，取1 ml +9 ml鹽水=10-1，逐管10倍稀釋為10-4約50100CFU/ ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。,菌液的檢驗(yàn),（1）取上述金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌、乙型溶血型鏈球菌、福氏痢疾菌、沙門(mén)菌10-5 10-7稀釋液各1ml，用45營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測(cè)定兩皿，3035培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)，應(yīng)約為50100cfu/ml。（2） 取上述白色念珠菌10-5 10-6稀釋液及上述黑曲霉菌10-4孢子懸液各1ml，用45琥紅瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測(cè)定兩皿，2328培養(yǎng),逐日觀察計(jì)數(shù)，應(yīng)約為50100cfu/ml。,供試液制備,稱(chēng)取樣品10 g ，加0.1%蛋白胨水氯化鈉稀釋液100ml濃度均為1：10供試液。,細(xì)菌、酵母菌及霉菌的方法學(xué)驗(yàn)證,（1）常規(guī)法：采用加1：10供試液1ml，分別人工接種上述5種陽(yáng)性代表試驗(yàn)菌株，50100CFU/ml，再加1520 ml瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2448小時(shí)觀察結(jié)果細(xì)菌計(jì)數(shù)，測(cè)定回收率結(jié)果見(jiàn)表2。 （2）培養(yǎng)基稀釋法： 采用加0.5ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供試液，人工接種上述敏感試驗(yàn)菌株，再加1520 ml瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2448小時(shí)觀察結(jié)果細(xì)菌計(jì)數(shù)，測(cè)定回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。（3）薄膜過(guò)濾法：分別取不同品種的1：10供試液取上清夜1ml加入濾器中、用0.1%蛋白胨氯化鈉稀釋液沖洗300ml/濾器再加規(guī)定敏感菌株沖洗后、取出濾膜貼規(guī)定培養(yǎng)基培養(yǎng)2472小時(shí)觀察結(jié)果見(jiàn)表4。,回收率測(cè)定：,（1）試驗(yàn)組：分別取不同品種的1：10供試液1 ml、50100CFU/ ml 試 驗(yàn)菌株同時(shí)加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2472小時(shí)觀察結(jié)果。薄膜過(guò)濾法以最后一次的沖洗液加入試驗(yàn)菌。（2）活菌組：測(cè)定每一菌株 加的試驗(yàn)菌數(shù)見(jiàn)表1（3）供試液對(duì)照：測(cè)定供試品本底菌數(shù)（略）（4）稀釋劑對(duì)照組。,回收率的計(jì)算,按如下公式計(jì)算試驗(yàn)組的加菌回收率：,（三）、控制菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證,當(dāng)建立藥品的微生物檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌的方法學(xué)驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查 （1）試驗(yàn)組 取1：10供試液，接入100 ml/瓶5瓶膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基和3瓶亞碲酸鹽肉湯增菌培養(yǎng)基中，（10 ml供試液 /瓶）其中1瓶接種大腸埃希菌、福氏痢疾、沙門(mén)菌供試液瓶、稀釋劑對(duì)照組瓶；其中1瓶接種乙型溶血性鏈球菌、供試液瓶、置35培養(yǎng)經(jīng)2448小時(shí)結(jié)果見(jiàn)表5。,（2）陰性菌對(duì)照組 a 取金黃色葡萄球菌50100cfu/ ml，接種 膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，置35培養(yǎng)經(jīng)2448小時(shí)，陰性菌對(duì)照菌組為陰性（未生長(zhǎng)）。 b取大腸埃希菌50100cfu/ ml， 接種亞酸鹽肉湯增菌培養(yǎng)基中置35培養(yǎng)經(jīng)2448小時(shí)，陰性菌對(duì)照菌組為陰性（未生長(zhǎng)）。,五、結(jié)果菌落計(jì)數(shù)表1 菌落計(jì)數(shù),表2 微生物限度檢查法驗(yàn)證常規(guī)法接種陽(yáng)性菌株的回收率（%）,注：2331為2006年檢驗(yàn)，控制菌全部按國(guó)標(biāo)GB/T4789.14789.31 2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)從表2結(jié)果中可以看出：32個(gè)品種分別接種5株代表菌，有16個(gè)品種回收率均超過(guò)70%，可采用常規(guī)方法進(jìn)行測(cè)定；另16個(gè)品種（活謂素得而樂(lè)膠囊、忘不了3A腦營(yíng)養(yǎng)、再高鐵兒童成長(zhǎng)口服液、血爾口服液、瞳神牌輕亮、養(yǎng)顏鹿胎粉、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、夢(mèng)玉膠囊、華濟(jì)堂牌護(hù)肝靈膠囊、二月紅牌紅潤(rùn)片、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片、全蟲(chóng)草膠囊）分別對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌有抑菌作用，染菌回收率%均低于70%，應(yīng)分別采用培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過(guò)濾法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。,表3 回收率小于70的品種采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2-0.5ml/皿）回收率（%）,從表3中結(jié)果看出,活謂素得而樂(lè)膠囊、忘不了3A腦營(yíng)養(yǎng)、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、華濟(jì)堂牌護(hù)肝靈膠囊等6個(gè)品種采用培養(yǎng)基稀釋法0.2ml/皿，全蟲(chóng)草膠囊和富威牌劍影膠囊采用培養(yǎng)基稀釋法0.5ml/皿，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌回收率均超過(guò)70%，使細(xì)菌正常生長(zhǎng)，可采用培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定。再高鐵兒童成長(zhǎng)口服液，養(yǎng)顏鹿胎粉經(jīng)培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）測(cè)定，對(duì)枯草桿菌回收率仍低于70%；二月紅牌紅潤(rùn)片采用稀釋法進(jìn)行檢測(cè)（0.5ml/皿）枯草桿菌回收率不穩(wěn)定，均低于70%，故用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。而對(duì)回收率很低品種，血爾口服液、瞳神牌輕亮膠囊、夢(mèng)玉膠囊、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片，可直接采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。,表16結(jié)果,132個(gè)品種其中天元甘露低聚果糖液、維生素E（加州熊）、海王金樽、神奇壽樂(lè)牌排鉛沖劑、新蓋中蓋高鈣片、龍希膳食纖維膠囊、紫薇卵磷脂膠囊、吾老七羊胎美容濃縮液、腦輕松膠囊、江中亮嗓胖大海、老舒君壓茶、前烈立舒膠囊、覺(jué)父膠囊、苦瓜精華素片、寧烈寧膠等16個(gè)品種可采用常規(guī)法進(jìn)行試驗(yàn)。2.活謂素得而樂(lè)膠囊、忘不了3A腦營(yíng)養(yǎng)膠囊、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、華濟(jì)堂牌護(hù)肝靈膠囊、全蟲(chóng)草膠囊、富威牌劍影膠囊8個(gè)品種細(xì)菌數(shù)可采用培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定。3. 血爾口服液、養(yǎng)顏鹿胎粉、再高鐵童少兒成長(zhǎng)膠囊、瞳神牌輕亮、夢(mèng)玉膠囊、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片和二月紅牌紅潤(rùn)片8個(gè)品種細(xì)菌數(shù)可采用薄膜過(guò)濾法測(cè)定。,4. 2005年所檢的22個(gè)品種沒(méi)有測(cè)定沙門(mén)菌，對(duì)于其他控制菌無(wú)抑菌活性，可采用常規(guī)法進(jìn)行測(cè)定。2006年所檢的10個(gè)品種其控制菌的檢查，按照國(guó)標(biāo)GB/T4789.14789.31 2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法測(cè)定了沙門(mén)菌，除華濟(jì)堂牌護(hù)肝靈膠囊采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行測(cè)定，前烈立舒膠囊、二月紅牌紅潤(rùn)片、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片、全蟲(chóng)草膠囊、覺(jué)父膠囊、苦瓜精華素片、寧烈寧膠囊富威牌劍影膠囊，對(duì)霉菌、控制菌均無(wú)抑菌活性，均可采用常規(guī)法進(jìn)行測(cè)定。,檢驗(yàn)結(jié)果分析,目前，保健食品按國(guó)標(biāo)GB/T4789.14789.31 2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，該標(biāo)準(zhǔn)中僅提供了一般檢驗(yàn)方法，并沒(méi)有提供方法驗(yàn)證的內(nèi)容和要求。而保健食品中一些成分和添加劑的使用往往對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有抑制作用，僅依據(jù)國(guó)標(biāo)（GB/T4789.14789.31 2003）方法無(wú)法去除這些因素對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響，從而無(wú)法保證結(jié)果的科學(xué)、可靠。為此采用2005版中國(guó)藥典微生物限度檢查方法驗(yàn)證的要求，對(duì)購(gòu)買(mǎi)的34個(gè)保健食品樣品進(jìn)行了微生物檢驗(yàn)的方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有大約50的樣品具有抑菌作用（見(jiàn)表1），高于中成藥30左右品種具有抑菌作用的比例，而且這些具有抑菌作用的品種大多可以采用培養(yǎng)基稀釋法去除抑菌活性（見(jiàn)表2），也有個(gè)別品種需要采用薄膜過(guò)濾法才能去除抑菌活性（見(jiàn)表3），這些情況也與中成藥微生物限度檢查方法驗(yàn)證情況相似。,討論：,僅依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T