細菌內(nèi)毒素檢查驗證方案模板

文件編號 驗證文件驗證文件 注射用注射用 細菌內(nèi)毒素檢查法驗證細菌內(nèi)毒素檢查法驗證方案方案 公司 1 6 驗驗 證證 文文 件件 公司 文件編號 目目 錄錄 1 適用范圍 2 目的 3 責任人 4 樣品的來源及實驗準備 5 內(nèi)毒素限值的確定 6 具體驗證步驟 5 1 鱟試劑靈敏度復核 5 2 干擾實驗 5 3 供試品的內(nèi)毒素檢查 7 注射用 細菌內(nèi)毒素檢查方法 2 6 驗驗 證證 文文 件件 公司 文件編號 1 適用范圍適用范圍 本驗證方案適用于注射用 細菌內(nèi)毒素檢查法的驗證 2 目的目的 建立該產(chǎn)品的細菌內(nèi)毒素檢查方法 并對其有效性進行評價 確保檢測方法的專屬 性 靈敏度 保證檢測結(jié)果可符合質(zhì)量標準要求 3 責任人責任人 細菌內(nèi)毒素檢驗員 QC 主管 4 樣品的來源及樣品的來源及實驗準備實驗準備 4 1 樣品的來源 使用的主要試劑及樣品的來源 使用的主要試劑及實驗條件和儀器實驗條件和儀器 注射用 注射用溶劑 批號 20100201 規(guī)格 5ml 生產(chǎn)廠 公司 注射用 批號 20100201 規(guī)格 500mg 生產(chǎn)廠 公司 鱟試劑 標示靈敏度為 0 25EU ml 批號 1110192 規(guī)格 0 1ml 生產(chǎn)廠 湛江安度斯生物有限公司 鱟試劑 標示靈敏度為 0 5EU ml 批號 1101050 規(guī)格 0 1ml 生產(chǎn)廠 湛 江博康生物有限公司 細菌內(nèi)毒素檢查用水 批號 1201160 規(guī)格 2ml 支 生產(chǎn)廠 湛江安度 斯生物有限公司 細菌內(nèi)毒素工作標準品 批號 1004020 效價 12EU 支 生產(chǎn)單位 湛江安度 斯生物有限公司 實驗用具 移液管 凝集管 三角瓶 試管 試管架 洗耳球 時鐘 75 酒精棉 剪刀 砂輪 其他玻璃實驗用具 250 1 小時滅菌處理后使用 4 2 實驗準備 4 2 1 玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡 然后取出將洗液空干 用自來水將殘留洗液徹底洗凈 再用蒸餾水反復沖洗三遍以上 空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi) 放置入烤箱 4 2 2 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻璃器皿置烤箱后 將烤箱調(diào)至 250 待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開始計時 干烤至少 1 小時 達到規(guī)定時間后 關(guān)斷電源 待烤箱溫度自然降至室溫 在不打開金屬容器的情況下 可在兩天內(nèi)使用 如果玻璃器 皿用錫箔紙包裝 在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用 否則須再次干烤除去可能存 在的外源性內(nèi)毒素 5 內(nèi)毒素限值的確定內(nèi)毒素限值的確定 根據(jù) 2010 年版中國藥典二部附錄 E 細菌內(nèi)毒素檢查法中規(guī)定 細菌內(nèi)毒素限值計 算公式 L K M 式中 L 為供試品的細菌內(nèi)毒素限值 本品以 EU mg 表示 K 為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量 注射劑 K 5EU kg h M 為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量 人均體重按 60kg 計算 人體表面 積按 1 62m2計算 注射時間若不足 1 小時 按 1 小時計算 本品以腺苷蛋氨酸計最大劑 量為 1000mg L 5EU kg h 60kg 1h 1000mg 0 3EU mg 因此本品的細菌內(nèi)毒素限值為 0 3EU mg 6 具體驗證步驟具體驗證步驟 6 1 鱟試劑靈敏度復核 6 1 1 實驗操作 6 1 1 1 細菌內(nèi)毒素標準溶液的制備 取細菌內(nèi)毒素工作標準品一支 輕彈瓶壁 使粉末落入瓶底 然后用砂輪在瓶頸上 部輕輕劃痕 75 酒精棉球擦拭后啟開 啟開過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi) 3 6 驗驗 證證 文文 件件 公司 文件編號 按照標準品說明書 加入規(guī)定量的細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物 用封口膜將 瓶口封嚴 置旋渦混合器上混合15分鐘 然后進行稀釋 制備成4個濃度的細菌內(nèi)毒素標 準溶液 即2 1 0 5 0 25 為所復核的鱟試對的標示靈敏度 每稀釋一 步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30 秒鐘 6 1 1 2 待復核鱟試劑的準備 取規(guī)格為0 1ml 支的鱟試劑18支 輕彈瓶壁 使粉末落入瓶底 用砂輪在瓶頸輕輕 劃痕 75 酒精棉球擦拭后啟開備用 防止玻璃屑落入瓶內(nèi) 每支加入0 1ml 檢查用水溶 解 輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁 使內(nèi)容物充分溶解 避免產(chǎn)生氣泡 6 1 1 3 加樣 將已充分溶解的待復核鱟試劑18支 管 放在試管架上 排成5列 其中4列4支 管 1列2支 管 4 支 管 4 列每列每支分別加入0 1ml 的2 0 5 和0 25 的內(nèi)毒素標準溶液 另2支 管 加入0 1ml檢查用水 6 1 1 4 加樣結(jié)束后 將鱟試劑用封口膜封口 輕輕振動混勻 避免產(chǎn)生氣泡 連同試管 架放入37 1 水浴或適宜恒溫器中 試管架保持水平狀態(tài) 保溫60 2 分鐘 6 1 1 5 觀察并記錄結(jié)果 將試管架從水浴中輕輕取出 避免振動 將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn) 180 觀察 管內(nèi)形成凝膠 并且凝膠不變形 不從管壁滑脫者為陽性 記錄為 未 形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性 記錄為 6 1 2 實驗結(jié)果計算 如最大濃度2 0 4管均為陽性 最低濃度0 25 4管均為陰性 陰性對照為陰性時實 驗為有效 按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復核結(jié)果 c c lg 1 X 4 式中x為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值 lg 反應(yīng)終點濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標準溶液 中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度 6 1 3 結(jié)果判斷 6 1 3 1 判斷標準 當 c在0 5 2 包括0 5 和2 時判定該批鱟試劑靈敏度復核合格 可用于干 擾實驗和供試品細菌內(nèi)毒素檢查 并以 標示靈敏度 為該批鱟試劑的靈敏度 6 1 3 2 判斷結(jié)果 記錄附后 6 2 干擾實驗 目的是檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用 使用 的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過所使用的鱟試劑的最大有效稀釋倍數(shù)的溶液 6 2 1 確定最大有效稀釋倍數(shù) MVD 樣品溶液的制備 取注射用 適量 約相當于含腺苷蛋氨酸500mg 加入注射 用溶劑5ml 再用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋至每1ml含腺苷蛋氨酸10mg的溶液 本品內(nèi)毒 素限值為0 3EU mg MVD cL L 0 3EU ml c 10mg ml 1 0 5 EU ml 2 0 25 EU ml 因此MVD1 6 MVD2 12 6 2 2 操作方法 6 2 2 1 制備內(nèi)毒素標準對照溶液 取1支細菌內(nèi)毒素標準品 用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標準溶液即 4 6 驗驗 證證 文文 件件 公司 文件編號 2 1 0 5 0 25 方法同6 1 1 1 6 2 2 2 制備含內(nèi)毒素的供試品溶液 取注射用 加入注射用溶劑并制成每1ml含腺苷蛋氨酸10mg的溶液 再根據(jù) MVD加入細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋 再用此稀釋液將6 2 3 1 中的同支細菌內(nèi)毒素標準品 稀釋成4個濃度即2 0 5 0 25 的含內(nèi)毒素的供試品溶液 6 2 2 3 鱟試劑的準備及加樣 取規(guī)格為0 1ml 支的鱟試劑36支 輕彈壁使粉末落入瓶底 用砂輪在瓶頸輕輕劃痕 75 酒精棉球擦拭后啟開備用 防止玻璃屑落入瓶內(nèi) 每支加入0 1ml檢查用水溶解 輕 輕轉(zhuǎn)動瓶壁 使內(nèi)容物充分溶解 避免產(chǎn)生氣泡 6 2 2 4 加樣 將準備好的鱟試劑取其中18支 管 放在試管架上 排成5列 4列4支 管 1列2 支 管 其中的4支4列每列每支分別加入0 1ml的2 0 1 0 0 5 0 25 的內(nèi)毒素 標準溶液 另一列2支 管 加入0 1ml檢查用水作為陰性對照 將另外18支 管 鱟試劑放在試管架上 排成5列 4列4支 管 1列2支 管 其中的4支4列每列每支分別加入0 1ml的含2 0 1 0 0 5 0 25 的內(nèi)毒素的供試品 溶液 另一列2支 管 加入0 1ml供試品溶液作為樣品陰性對照 加樣結(jié)束后 用封口膜 封口 輕輕振動混勻 避免產(chǎn)生氣泡 連同試管架放入37 1 水浴或適宜恒溫器中 保 溫60 2分鐘后 觀察并記錄結(jié)果 6 2 3 實驗結(jié)果計算 如兩組最大濃度2 0 均為陽性 最低濃度0 25 均為陰性 陰性對照 管均為陰性時 按下式計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標準溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值 Es 和用供試 品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值 Et Es lg 1 Xs 4 Et lg 1 Xt 4 Xs Xt分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的 對數(shù)值 lg 6 2 4 結(jié)果判斷 6 2 4 1 判斷標準 當Es在0 5 2 0 包括0 5 和2 0 時 且Et在0 5 Es 2 0Es 包括0 5 Es和 2 0Es 時 則認為供試品在該濃度下不干擾實驗 可在該濃度下對此供試品進行細菌內(nèi) 毒素檢查 當Et不在0 5 Es 2 0Es 包括0 5 Es和2 0Es 時 則認為供試品在該濃度下干擾實驗 6 2 4 2 判斷結(jié)果 記錄附后 6 3 供試品細菌內(nèi)毒素檢查 在細菌內(nèi)毒素檢查中 每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照 同時 每次實驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照 6 3 1 操作方法 6 3 1 1 供試品溶液的制備 稀釋倍數(shù)不得超過MVD 6 3 1 2 陽性對照溶液的制備 用檢查用水將內(nèi)毒素標準品稀釋制成2 濃度的內(nèi)毒素標準溶液 方法同6 1 1 1 6 3 1 3 供試品陽性對照溶液的制備 用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標準品制成2 濃度的內(nèi)毒素溶液 方 5 6 驗驗 證證 文文 件件 公司 文件編號 法同6 2 2 2 供試品陽性對照溶液的制備 6 3 1 4 陰性對照液用細菌內(nèi)毒素檢查用水 6 3 1 5 鱟試劑的準備 取規(guī)格為0 1ml 支的鱟試劑8支 輕彈瓶壁使粉末落入瓶底 用砂輪在瓶頸輕輕劃痕 75 酒精棉球擦拭后啟開備用 防止玻璃屑落入瓶內(nèi) 每支加入0 1ml檢查用水溶解 輕 輕轉(zhuǎn)動瓶壁 使內(nèi)容物充分溶解 避免產(chǎn)生氣泡 6 3 1 6 加樣取8支 管 溶解好的鱟試劑 其中2支加入0 1ml供試品溶液或其稀釋液作為 供試品管 2支加入0 1ml陽性對照溶液作為陽性對照管 PC 2支加入0 1ml檢查用水作 為陰性對照管 NC 2支加入0 1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管 PPC 6 3 1 7 將試管中溶液輕輕混勻后 用封口膜封閉管口 垂直放入37 1 水浴或適宜 恒溫器中 保溫60 2分鐘 保溫和取放試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果 6 3 2 結(jié)果判斷 6 3 2 1 判斷標準 當陽性對照都為陽性 供試品陽性對照都為陽性且陰性對照都為陰性時 實驗有效 若供試品2管均為陰性 認為該供試品