引物設(shè)計-hyb總結(jié).docx

引 物 設(shè) 計一.引物設(shè)計原則首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。二.引物設(shè)計注意的要點1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。 2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。 3. 引物3端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標(biāo)記物。 4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。 6. G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G值較低（絕對值不超過9），而5端和中間G值相對較高的引物。引物的3端的G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。 7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。 8. 對引物的修飾一般是在5端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。 三.引物設(shè)計的步驟1.打開NCBI的主頁，選擇UniSTS,填寫目的基因，選擇符合要求的引物，導(dǎo)入blast和primer5檢測是否符合要求，如果不符合要求再自己重新設(shè)計。2.打開NCBI頁面，選擇Gene,填寫需要查找的基因及源種（例如小鼠mus）,找到mRNA的序列號，點擊打開，找到相應(yīng)的mRNA，把序列或者mRNA的accession序號導(dǎo)出到word里面，找出含有內(nèi)含子的位置，做好標(biāo)記(從進入Gene頁面后，點擊Genbank,可以了解這個基因的大小，以及內(nèi)含子與外顯子的大小)或者把mRNA的accession序號導(dǎo)入priemerDesigning tool里面，擴增產(chǎn)物是200-250，TM 58-62，至少包含一個內(nèi)含子，內(nèi)含子長度可慢慢調(diào)試，最終要求Tm,GC%都比較接近，同時self3complementarity的值不能超過3，self complementarity不能超過6，這2個值越低越好。3.根據(jù)引物設(shè)計原則，從mRNA序列中找相應(yīng)的序列作為引物，上引物是5到3，下引物就是與mRNA序列反向互補的。4.把設(shè)計的引物導(dǎo)入blast里檢測下在所有基因中是否有非特異性擴增。5.把全部mRNA序列導(dǎo)入primer5中，查看引物的Tm,GC%含量，是否有發(fā)夾結(jié)構(gòu)與二聚體結(jié)構(gòu)，以及錯配率，得分，確定引物的可用性。1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產(chǎn)，無論采用什么機器合成，合成的原理都相同，主要差別在于合成產(chǎn)率的高低，試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的多少。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3端向5端合成的，相鄰的核苷酸通過35磷酸二酯鍵連接。第一步是將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5-羥基；第二步，合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3端被活化，5-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。第三步，帶帽(capping)反應(yīng)，縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5-羥基沒有參加反應(yīng)(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，這種短片段可以在純化時分離掉。第四步，在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙酸脫去它的5-羥基上的保護基團DMT，重復(fù)以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC, PAGE等手段純化引物，成品引物用C18濃縮,脫鹽，沉淀。沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量，根據(jù)定單要求分裝。2.引物純化方式有哪些，如何選擇？C18柱脫鹽：有人稱其為簡易反相柱，它對DNA有特異性的吸附，可以被有機溶解洗脫，但不會被水洗脫，所以能有效地去除鹽分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。實際上，它是一種脫鹽的作用。這種方法一般不會對普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。OPC純化： OPC純化是根據(jù)DNA保護基（DMTr基）和Cartridge柱中樹脂間的親合力作用的原理進行純化目的DNA片段。OPC法純化的DNA純度大于95%。適用于40mer以下引物的純化。PAGE純：PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于95%，對長鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。HPLC純化：HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。3.引物的OD數(shù)如何定量？答：引物合成引物OD數(shù)是這樣測定的：用紫外分光光度計，波長260nm，石英比色杯，光程為1厘米，測定溶液的光密度。測定時溶液的光密度最好稀釋到0.2-1.0之間。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，用1ml水稀釋測OD值。需要根據(jù)稀釋倍數(shù)換算出母液的OD值。4.需要什么級別的引物？答：引物常用的純化方式C18脫鹽，OPC純化，PAGE純化，HPLC純化。根據(jù)實驗需要，確定訂購引物的純度級別。應(yīng)用引物長度要求純度級別要求一般PCR擴增45 basePAGE診斷PCR擴增 40baseOPC, PAGEDNA測序20base左右OPC亞克隆，點突變等根據(jù)實驗要求定OPC, PAGE，HPLC基因構(gòu)建（全基因合成）根據(jù)實驗要求定PAGE反義核酸根據(jù)實驗要求定PAGE修飾引物根據(jù)實驗要求定PAGE, HPLC5.最長可以合成多長的引物？答：引物越長，出現(xiàn)問題的概率就越大。我們合成過120base的引物，但是產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長度不要超過80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長（還不一定正確）引物的百分比不會超過40%，后續(xù)處理還有丟失很多，最后的產(chǎn)量是很低。6.需要合成多少OD數(shù)？答：根據(jù)實驗?zāi)康拇_定。一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。片段越長, 最后全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求，其實也是對社會資源的一種浪費，同時也從一個側(cè)面反映了部分研究人員，特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復(fù)多次才能成功。7.如何檢測引物的純度？答：實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。8.如何計算引物的濃度？答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩(wěn)定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 溶解前您需要核對合成報告單和引物標(biāo)簽上的引物OD數(shù)是否一致。如果不一致，請和我們聯(lián)系。我們可以根據(jù)生產(chǎn)記錄查到實際產(chǎn)量是多少。一般情況下，我們建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計算：V (微升)= OD數(shù)*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。注意：1 OD260= 33 ug/ml.9.如何計算引物的Tm值？答：引物設(shè)計軟件都可以給出Tm，引物長度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強度有關(guān)。長度為25mer以下的引物，Tm計算公式為：Tm = 4(G + C)+ 2(A + T)對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10Na+ + 0.41 (%GC) 600/size公式中，Size = 引物長度。Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.10.引物（含修飾）的分子量是如何確定的？答：非修飾的引物的Molecular Weight在隨引物提供的報告單上都有明確的標(biāo)示。如果需要估計一個引物的分子量按每個堿基的平均分子量為324.5，引物的分子量=堿基數(shù) x 堿基的平均分子量?；虬聪铝泄接嬎鉓W= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) （Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns 62.NA, NG, NC, NT, Ni分別為引物中堿基A或G或C或T或I的數(shù)量，WA, WC, WG, W, Wi分別為引物中堿基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分別為修飾基團的數(shù)目和分子量。對于混合堿基的分子量為混合堿基的分子量總合除以混合數(shù)，例如G+A混合的分子量為（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns為硫代數(shù)目，硫代每個位置增加分子量16。常規(guī)堿基分子量BaseMolecular WeightA313.21C289.18G329.21T304.19I314.2U290.17常規(guī)修飾基團分子量5-Biotin405.453-TAMARA623.605-(6 FAM)537.463-Dabsyl498.495-HEX744.133-(6 FAM)569.465-TET675.243-Amino Modifier C3153.075-Cy5533.633-Amino Modifier C7209.185-Cy3507.593-Thiol Modifier C3154.1211.如何溶解引物？答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前最好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。12.如何保存引物？答：引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重復(fù)性要求較高，合成的OD數(shù)較大，建議分裝，避免反復(fù)凍融。修飾熒光引物需要避光保存。13.合成的引物5端是否有磷酸化答：合成的引物5為羥基，沒有磷酸基團。如果需要您可以用多核苷酸激酶進行5端磷酸化，或者要求我們合成時直接在5或3端進行磷酸化，需要另外收費。14.引物片段退火后不能連接到載體上是什么問題？連接反應(yīng)需要引物的5磷酸基團。如果需要將合成的引物退火直接連接相應(yīng)的載體上，引物需要磷酸化。磷酸化的產(chǎn)物如果還不能連接載體上，需要檢查載體的酶切效果，需要改善引物退火的條件。SiRNA分子具有特殊的對稱結(jié)構(gòu)，退火的難度較大，退火時需要提高退火溫度。15.測序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？答：測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯的機會不多。我們有一套控制辦法，預(yù)防堿基輸入錯誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，合成效率最高也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應(yīng)不徹底造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)5-羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補鏈配對，當(dāng)擴增的產(chǎn)品被亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可能被細菌中修復(fù)系統(tǒng)補上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復(fù)制和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應(yīng)用到規(guī)?；a(chǎn)中。16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？答：引物合成時，每一步反應(yīng)效率都不能達到100%，產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能絕對保證擴增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。17.如果測序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？答：對您遇到的困惑，我們表示同情。遇到這種情況，首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，我們在電腦中保留所有原始數(shù)據(jù)。如果確認引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。根據(jù)我們經(jīng)驗，40個堿基以下的引物，測1-2個克隆就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率。基因拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。18.引物是經(jīng)過PAGE純化的，為什么還有堿基缺失或插入？答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內(nèi)有一個不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問題可能就會少一些。19. TaqMan 探針設(shè)計的基本原則是什么？答：下列原則供您參考。TaqMan 探針位置盡可能靠近擴增引物（擴增產(chǎn)物50-150bp），但不能與引物重疊。長度一般為18-40mer 。G-C含量控制在40-80%左右。避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。在引物的5端避免使用G。選用比較多的堿基C。退火溫度Tm控制在 68-70C左右。有用的熒光染料參數(shù)NameName吸收波長發(fā)射波長colors6-FAM6-carboxy-fluorescein494nm518nmGreenTET5-tetrachloro-fluorescein521nm538nmOrangeHEX5-hexachloro-fluorescein535nm553nmPinkTAMRAtetramethyl-6-carboxyrhodamine560nm582nmRoseROX6-carboxy-x-rhodamine587nm607nmRedCy3Indodicarbocyanine552nm570nmRedCy5Indodicarbocyanine643nm667nmViolet20.Primer設(shè)計的基本原則是什么？答：引物設(shè)計的下列原則供您參考。引物長度一般在18-35mer。G-C含量控制在40-60%左右。避免近3端有酶切位點或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。如果可能避免在3端最后5個堿基有2個以上的G或C。如果可能避免在3端最后1個堿基為A。避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。退火溫度Tm控制在 58-60C左右。如果是設(shè)計點突變引物，突變點應(yīng)盡可能在引物的中間。21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？答：我們多次接到類似的投訴：引物應(yīng)該全是DNA,但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質(zhì)污染？遇到這樣的投訴有時我們感到很是為難。投訴者有時心情很不好，還不聽解釋。撇開其他不談，引物化學(xué)合成，哪里有機會污染到蛋白質(zhì)？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base CompositionsBase CompositionA260/2805-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-32.505-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-31.855-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-31.155-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-31.145-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-31.6622.同樣的OD用PAGE檢測，EB染色為什么深淺不一？答：通?？梢杂肊B染色的方法來判斷雙鏈DNA的量(如質(zhì)粒DNA)，因為EB可以嵌合到雙鏈DNA中。而合成的單鏈DNA，由于堿基組成不同，形成二級結(jié)構(gòu)的可能性不同，EB的染色程度也會有差異，比如Oligo(dT)等不形成二級結(jié)構(gòu)，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法來定量，而用紫外分光光度計檢測。同樣道理，用EB染色來照片不適合所有引物。23.引物不純會有什么后果？答：引物不純可能會導(dǎo)致：1)非特異性擴增；2)無法用預(yù)先設(shè)計在引物5端酶切位點的酶切開，特別是沒有保護堿