8、DNA（羥）甲基化.docx

分子機(jī)制研究套路（八）DNA（羥）甲基化課題：C因素激活A(yù)蛋白對B基因啟動子DNA甲基化的調(diào)控對D疾病的影響1概念介紹：表觀遺傳學(xué)是當(dāng)今生命科學(xué)普遍關(guān)注的前沿，是一種可遺傳的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制，不同于經(jīng)典遺傳學(xué)，不涉及到基因序列的改變,而且表觀遺傳修飾是可逆的，在基因調(diào)控中起重要作用。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)主要調(diào)控機(jī)制之一，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變以及人類疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, SAM）提供甲基、在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase, DNMT）的催化下，在胞嘧啶的C5位上面加上一個甲基，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化學(xué)修飾過程。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(如DNMTs)與DNA去甲基化酶(如TET蛋白等)調(diào)控基因組DNA序列甲基化的動態(tài)變化，一般來說，基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化可以使一些轉(zhuǎn)錄因子無法與DNA結(jié)合而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，而該區(qū)域的去甲基化則可以激活基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG異二核苷酸上面（如示意圖1），而CpG在人類基因組中出現(xiàn)的幾率比較低，主要集中出現(xiàn)在CpG島（CpG island）上面。CpG島是指由200bp的堿基組成的DNA序列，其中GC含量占60%以上的一個區(qū)域，這個區(qū)域主要位于某些基因的啟動子區(qū)域。CpG島上DNA的甲基化是表觀遺傳學(xué)研究中的一個重點，其可改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)、影響鄰近基因的表達(dá)。高度甲基化的DNA與組蛋白結(jié)合緊密并且能夠招募轉(zhuǎn)錄抑制因子、抑制轉(zhuǎn)錄激活因子與啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而達(dá)到抑制基因表達(dá)的目的；而DNA的低甲基化使得染色體結(jié)構(gòu)松散，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活因子和RNA多聚酶與靶序列的結(jié)合，從而驅(qū)使相關(guān)基因的高表達(dá)。圖1：DNA 在CpG 異二核苷酸上的甲基化示意圖表觀遺傳學(xué)最先用于腫瘤的研究中。在許多腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CpG島高度甲基化，從而抑制抑癌基因的表達(dá)，誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生，因此DNMT抑制劑5-氮胞苷（5-AZA）等被用于腫瘤的臨床治療。2示意圖：DNA甲基化循環(huán)的過程如圖2：通過SAM提供甲基，在DNMT的催化下完成甲基化過程，于此同時會產(chǎn)生副產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine, SAH），SAH進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為高半胱氨酸，而高半胱氨酸是這個循環(huán)中的關(guān)鍵組分，研究表明升高的高半胱氨酸能夠損傷DNA的修復(fù)機(jī)制，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的紊亂。從循環(huán)圖中可以得知，高半胱氨酸具有2條去路，一方面可以形成甲硫氨酸重新參與甲基化循環(huán)，另一方面可以被分解代謝為半胱氨酸。高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸的過程是在甲硫氨酸合成酶的作用下完成的，但是需要維生素B12和5-甲基四氫葉酸的輔助，而5-甲基四氫葉酸又需要通過食物中的葉酸轉(zhuǎn)化而來；高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸也需要維生素B6的參與。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)維生素B6、維生素B12和葉酸的缺乏與高半胱氨酸水平升高密切相關(guān)，因此，可以通過食物療法來保證維生素B12、維生素B6和葉酸的供應(yīng)，達(dá)到防止疾病的目的。圖2：DNA甲基化循環(huán)過程3研究思路：3.1 D疾病中B基因啟動子調(diào)控序列甲基化狀態(tài)及其與B蛋白表達(dá)相關(guān)性分析43.1.1D疾病組與正常對照組細(xì)胞基因組DNA整體甲基化水平43.1.2D疾病和正常對照組細(xì)胞B基因啟動子調(diào)控序列DNA甲基化水平.43.1.3D疾病和正常對照組細(xì)胞B蛋白表達(dá)水平及其與B基因啟動子調(diào)控序列DNA甲基化水平相關(guān)性分析43.2補(bǔ)丁甲基化技術(shù)構(gòu)建特殊報告載體檢測DNA甲基化對B基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控53.2.1成功構(gòu)建B基因啟動子調(diào)控序列PGL-3promoter熒光素報告載體53.2.2質(zhì)粒PCR大量擴(kuò)增B基因啟動子調(diào)控序列片段53.2.3體外人工甲基化及甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶酶切鑒定53.2.4檢測CpG甲基化和未甲基化目的片段熒光素報告載體熒光素活性53.3A蛋白對B基因啟動子DNA甲基化及轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的分子機(jī)制63.3.1A蛋白募集去甲基化酶TET2結(jié)合至B基因啟動子序列63.3.2A蛋白促進(jìn)細(xì)胞B基因啟動子去甲基化63.3.3C因素促進(jìn)細(xì)胞B蛋白表達(dá)63.1 D疾病中B基因啟動子調(diào)控序列甲基化狀態(tài)及其與B蛋白表達(dá)相關(guān)性分析3.1.1D疾病組與正常對照組細(xì)胞基因組DNA整體甲基化水平用磁珠分選法分離10例D疾病患者及正常對照細(xì)胞，提取基因組DNA，用MethylampTM整體DNA甲基化檢測試劑盒檢測D疾病與正常對照細(xì)胞基因組DNA整體甲基化水平。結(jié)果顯示D疾病組細(xì)胞基因組DNA整體甲基化較正常對照組明顯下降。注釋：1）疾病組和對照組樣品，如果可獲得臨床樣本最好，如果沒有，可用同一組織類型的疾病細(xì)胞系和正常細(xì)胞系。2）如果是臨床樣本，細(xì)胞的分離方法不一定是磁珠分選法，還可以用流式細(xì)胞儀分選等，需根據(jù)疾病類型的不同進(jìn)行調(diào)整。3）疾病組DNA整體甲基化水平降低還是升高，關(guān)鍵取決于B基因?qū)膊〉呢暙I(xiàn)，若促進(jìn)疾病，則大多甲基化水平降低；若抑制疾病，則大多甲基化水平升高。3.1.2D疾病和正常對照組細(xì)胞B基因啟動子調(diào)控序列DNA甲基化水平.首先確定B基因啟動子中CpG島的位置，然后在CpG島內(nèi)確定CpG 位點，檢測所有CpG 位點DNA甲基化水平。亞硫酸鹽處理基因組DNA，巢式PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)物，T載體克隆測序檢測調(diào)控序列CpG島甲基化水平。結(jié)果顯示D疾病組細(xì)胞B基因啟動子區(qū)所有CpG位點整體DNA甲基化水平較正常對照組明顯降低。3.1.3D疾病和正常對照組細(xì)胞B蛋白表達(dá)水平及其與B基因啟動子調(diào)控序列DNA甲基化水平相關(guān)性分析用實時定量PCR檢測D疾病和正常對照組單核細(xì)胞B蛋白mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示D疾病組細(xì)胞B蛋白mRNA水平較正常對照組明顯升高。用Western blot法檢測D疾病和正常對照組細(xì)胞B蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示D疾病組細(xì)胞B蛋白水平較正常對照組明顯升高。D疾病與正常對照組細(xì)胞B基因啟動子DNA甲基化水平與B蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。3.2補(bǔ)丁甲基化技術(shù)構(gòu)建特殊報告載體檢測DNA甲基化對B基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控3.2.1成功構(gòu)建B基因啟動子調(diào)控序列PGL-3promoter熒光素報告載體用T4連接酶將B基因啟動子調(diào)控序列片段（用體外甲基化技術(shù)使目的片段CpG甲基化，并用未甲基化作陰性對照）與酶切處理線狀報告載體連接，用DH5大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化純化載體質(zhì)粒。用雙酶切鑒定，質(zhì)?；蚪M測序及Pubmed BLAST序列對比鑒定獲得含有B基因啟動子調(diào)控序列PGL-3promoter突光素報告載體。注釋:雙酶切時具體選擇何種酶取決于質(zhì)粒載體上的多克隆位點，且插入序列中不可含有所用酶的酶切序列。3.2.2質(zhì)粒PCR大量擴(kuò)增B基因啟動子調(diào)控序列片段為了獲得大量純化的B基因啟動子調(diào)控序列片斷，利用報告載體為模板，運用質(zhì)粒PCR技術(shù)，大量擴(kuò)增目的片段，利用膠回收技術(shù)純化回收目的片段。3.2.3體外人工甲基化及甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶酶切鑒定利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶Aci I酶切鑒定體外甲基化程度， Aci I酶切位點為5-CC GC-3或3-GGCG-5,而如果酶切位點受CpG甲基化保護(hù)不被酶切；體外人工甲基化使CpG甲基化組目的片段完全甲基化不被酶切為完整的片段，而模擬甲基化組目的片段未甲基化，被Aci I酶切為兩個片段，證實體外人工甲基化成功,獲得完全CpG甲基化/模擬甲基化目的片段。3.2.4檢測CpG甲基化和未甲基化目的片段熒光素報告載體熒光素活性將CpG甲基化和未甲基化目的片段熒光素報告載體與pRL家族海腎熒光素酶(Rluc)對照報告基因載體共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞株培養(yǎng)48小時，利用雙熒光素酶報告載體檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性,比較CpG甲基化和模擬甲基化目的片段熒光素報告載體熒光素酶活性。結(jié)果顯示B基因啟動子調(diào)控序列是甲基化敏感位點，B基因啟動子受DNA甲基化調(diào)控。3.3A蛋白對B基因啟動子DNA甲基化及轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控的分子機(jī)制3.3.1A蛋白募集去甲基化酶TET2結(jié)合至B基因啟動子序列分離3例健康志愿者細(xì)胞，用C因素激活A(yù)蛋白，用免疫共沉淀(IP)法證實A蛋白募集去甲基化酶TET2蛋白；用染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)-qPCR證實A蛋白結(jié)合至單核細(xì)胞B基因啟動子CpG序列。3.3.2A蛋白促進(jìn)細(xì)胞B基因啟動子去甲基化為了證實A蛋白募集的TET2蛋白是否引起B(yǎng)基因啟動子去甲基化，用亞硫酸鹽測序法檢測C因素處理組及對照組單核細(xì)胞B基因啟動子CpG島上CpG位點DNA甲基化水平。結(jié)果顯示，C因素處理組B基因啟動子DNA甲基化水平較對照組明顯下降，提示A蛋白募集 TET2 蛋白導(dǎo)致單核細(xì)胞B基因啟動子去甲基化。3.3.3C因素促進(jìn)細(xì)胞B蛋白表達(dá)在3.2部分已用補(bǔ)丁甲基化熒光素報告載體技術(shù)證實B基因轉(zhuǎn)錄受DNA甲基化調(diào)控，為闡明C因素通過A蛋白/TET2通路引起的B基因啟動子去甲基化是否促進(jìn)細(xì)胞B蛋白表達(dá)，通過流式細(xì)胞儀檢測C因素處理組及對照組單核細(xì)胞B蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)C因素促進(jìn)單核細(xì)胞B蛋白的表達(dá)。4應(yīng)用案例：1.Liang Y, Wang P