細菌耐藥性監(jiān)測與臨床.ppt

1、細菌耐藥性監(jiān)測與臨床,省立醫(yī)院檢驗科 李華,為什么要檢測耐藥菌,感染病原的變遷造成現(xiàn)代感染模式 耐藥菌株的流行 臨床的需要(指導感染性疾病的個體化治療，細菌的耐藥性監(jiān)測指導經(jīng)驗治療),2007年腸桿菌屬細菌耐藥率（%）,2007年12家醫(yī)院3988株銅綠假單胞菌耐藥率（%）,2007年12家醫(yī)院3157株不動桿菌屬細菌的耐藥率（%）,細菌產(chǎn)生耐藥性的原因,分裂繁殖方式： 以其二分裂繁殖方式使自身可在很短的時間里分裂繁殖，使自身增加數(shù)百億萬倍，有利于耐藥性的播散。 耐藥機制的產(chǎn)生： 細菌可以通過多種耐藥機制對抗生素產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生各種滅活酶、抗生素膜滲透障礙、靶位的改變等.,細菌產(chǎn)生耐藥性的原因

2、,抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)和廣泛應用 環(huán)境的原因 早在抗生素應用以前有些細菌就具有備抗藥基因。細菌存在于地球上已有3乙多萬年了，早在人工合成的抗生素使用之前，細菌就與自然界中的一些天然的抗菌成分以及其他微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)廣泛接觸而獲得了耐藥基因。（放線菌的代謝產(chǎn)物、天然的植物、中草藥等）。,菌產(chǎn)生耐藥性的原因,自從青霉素（1942年在美國首次）應用于臨床后2-3年內(nèi)，75%的葡萄球菌對其產(chǎn)生了抗藥性，目前葡萄球菌產(chǎn)酶株在95%-100%，對青霉素均耐藥。1959年耐酶青霉素的合成并投入使用，僅2年時間1961年英國就報道分離出MRSA并且耐藥菌迅速在世界擴散。目前我國臨床實驗室分離的金葡菌有近50%

3、的為MRSA。,耐藥菌產(chǎn)生的原因,耐藥菌株被迅速選擇和擴散： 1940-1960：青霉素時代 1960-1973:廣譜青霉素、二代頭孢時代 1978-1995：廣譜內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類 其結果：耐藥菌株被迅速選擇和擴散,菌產(chǎn)生耐藥性的原因,在世界許多地方，抗生素使用于農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、林業(yè)水產(chǎn)及家禽養(yǎng)殖業(yè)中，在施肥與飼料中被常加入抗生素，這樣做結果是大量殺滅了自然界中的敏感菌株而選擇出了耐藥菌株，這些耐藥菌株最終可以通過食物鏈或直接接觸傳遞給人。,細菌產(chǎn)生耐藥性的原因,世界范圍內(nèi)迅速擴散 人口密度過大 1萬年前地球人口只有100200萬，而現(xiàn)在已有60億，人群之間有了更多接觸機會；高度繁榮的旅游業(yè)、

4、大量的旅游流動人口，使在某一處發(fā)生的耐藥菌可以沒有國界地迅速地擴散到世界各地。,細菌產(chǎn)生耐藥性的原因,正常情況下，每一類細菌產(chǎn)生的耐藥性只發(fā)生于少數(shù)細菌中，難以與壓倒多數(shù)的優(yōu)勢敏感菌競爭，故危害性較小，只有當敏感菌因抗生素的選擇壓力作用下而被大量殺滅后。耐藥菌才大量繁殖而成為優(yōu)勢菌，并導致耐藥菌的產(chǎn)生。因此，細菌耐藥性的發(fā)生和發(fā)展是抗菌藥物廣泛應用尤其特別是無指征濫用的結果。,細菌產(chǎn)生耐藥性的原因,現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展促進了耐藥菌的產(chǎn)生 新的技術如靜脈導管、人工瓣膜、介入治療、切開引流、人工呼吸等，為一些機會致病菌提供了進入人體的通道，而這些機會致病菌比有毒力的致病菌更易產(chǎn)生耐藥性。,細菌產(chǎn)生耐藥性

5、的原因,此外，大量抗生素的發(fā)現(xiàn)使臨床醫(yī)生有過多的選擇余地，所以在感染性疾病的治療上很少強調(diào)改善宿主的功能，也不采用針對不同病原菌敏感的抗生素治療，而一開始就選擇使用廣譜抗生素其，結果必然是導致了大量耐藥菌株的產(chǎn)生?？咕幬锏氖褂貌划斖瑫r也促進了耐藥菌在機體內(nèi)和醫(yī)院環(huán)境中的定植繁衍，進而導致交叉感染和內(nèi)源性感染日益增多。,細菌的耐藥機制,遺傳學機制： 染色體介導的耐藥/突變耐藥 質(zhì)粒介導的耐藥性/獲得性耐藥 生物化學機制表達： 產(chǎn)生滅活酶/鈍化酶 抗生素滲透障礙 靶位的改變 其他機制 產(chǎn)生拮抗物 改變代謝狀態(tài)、如呈休眠狀態(tài)、營養(yǎng)缺陷等,細菌的耐藥機制,臨床病原菌產(chǎn)生的重要的水解酶,窄譜-內(nèi)酰胺酶

6、 -內(nèi)酰胺酶 超廣譜酶 AMpC酶 KPC酶 其他酶,臨床上最重要的革蘭陰性菌內(nèi)酰胺酶,超廣譜內(nèi)酰胺酶（ESBLs） 頭孢菌素酶（ AmpC酶） 碳青霉烯酶（KPC酶）,革蘭陰性菌對內(nèi)酰胺類藥物的耐藥性及檢測方法,內(nèi)酰胺酶的分類 1耐藥機制分類 質(zhì)粒介導 TEM、 SHV、 OXA等 染色體介導TYPE(AmpC酶) 2分子生物學分類（Ambler) A、B、C、D四類 功能分類Bush分類 1、2、3、4個組,超廣譜內(nèi)酰胺酶Extended Spectrhm-lactamases,基本概念 （1） 主要由肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌等腸桿科細菌產(chǎn)生. （2）在體外試驗中可使三代頭孢和氨曲南的抑菌

7、圈縮小，但并不一定在耐藥范圍。 （3）加入克拉維酸可使抑菌圈擴大（對酶抑制劑敏感）。 （4）臨床對內(nèi)酰胺類藥物（包括青霉素類和頭孢類）耐藥，但對碳青霉烯類和頭霉烯類藥物敏感。 （5）由質(zhì)粒介導，往往由普通的內(nèi)酰胺酶基因突變（TEM-1，TEM-2和SHV-1）而來。,ESBLs的發(fā)現(xiàn)和流行情況,產(chǎn)生基礎 最常見的由質(zhì)粒介導的內(nèi)酰胺酶是TEM-1，TEM-2和SHV-1酶，這些酶僅對第一代頭孢菌素有弱水解活性（廣譜酶）。80年代中期，由于臨床上廣泛使用頭孢類抗生素尤其是頭孢他啶和頭孢曲松，導致TEM-1和SHV-1內(nèi)酰胺酶突變酶的出現(xiàn)。 首次發(fā)現(xiàn) 1982年，英國 1983年，德國 目前狀況 肺

8、炎克雷伯菌是產(chǎn)生ESBL的最常見菌，產(chǎn)酶可高達40%以上，我院2007年肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBL達37%38%，大腸產(chǎn)酶達40%，腸桿科其他菌如產(chǎn)酸克雷伯菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌中也可分離到ESBL。,腸桿科細菌產(chǎn)ESBLs概況,TEM-1 最普遍 ,典型的情況是TEM-型和SHV-型的ESBLs由大的多重耐藥質(zhì)粒編碼 ESBLs類型多且都有自己特異的底物和酶活性，是針對不同類型的廣譜內(nèi)酰胺類抗生素或內(nèi)酰胺酶抑制劑產(chǎn)生的耐藥 ,迄今已發(fā)現(xiàn)有上百種類型的ESBLs 腸桿科細菌大多都具產(chǎn)酶能力.,ESBLs流行特點,1、世界范圍流行，但有區(qū)域性 2、確切的流行情況不清楚（耐藥表型不明確，有不均一

9、表現(xiàn)） 3、主要見于醫(yī)院感染 4、ESBLs的編碼基因在質(zhì)粒上，易造成在不同菌株中的播散， 5 、對酶抑制劑敏感； 對EDTA不敏感 ；,ESBLs的耐藥機制,基因突變 耐藥基因由質(zhì)粒攜帶 ESBLs 多由普通的內(nèi)酰胺酶基因發(fā)生突變而來。 GlySer-238突變引起酶的活性區(qū)擴大，導致對氧化亞氨基頭孢菌素的親和力和水解活性升高，體外誘變也證實第168和238位的置換可增強對氧化亞氨基內(nèi)酰胺類抗生素的水解活性。,ESBLs耐藥特點,1、青霉素類、一、二、三代頭孢菌素、（部分可水解四代）和單環(huán)酰類抗生素均耐藥 2、對碳青霉烯類和頭霉素類敏感 3、對酶抑制劑敏感 4、產(chǎn)生ESBLs的細菌往往多重耐

10、藥。其質(zhì)粒上常有氨基糖苷類、氯霉素或TMP-SMZ等的耐藥基因。（例有統(tǒng)計產(chǎn)酶株AMK70.37%耐藥、CIP75.30%耐藥；不產(chǎn)酶株分別為13.20%、35.81%）,產(chǎn)ESBLs細菌感染的臨床表現(xiàn),1、臨床表現(xiàn)難以治愈的感染或反復復發(fā)的感染。 2、三代頭孢菌素治療臨床無效。,ESBLs表型的檢測,篩選試驗 標準紙片瓊脂擴散法 MIC肉湯稀釋法檢測 雙紙片協(xié)同試驗 確認試驗 紙片確認試驗 MIC肉湯稀釋法 儀器 E-test PCR檢測,標準紙片瓊脂擴散法,培養(yǎng)基 ： Muller-Hinton瓊脂 藥敏紙片 頭孢泊肟(10ug/片) 、頭孢他啶、頭孢曲松、 頭孢噻肟和氨曲南（均為30ug

11、/片）中 至少二種： 接種方法 標準紙片擴散法 孵育條件、時間： 35、 空氣、1618小時,標準紙片瓊脂擴散法,判斷標準 ： 頭孢泊肟的抑菌環(huán)直徑17mm 頭孢他啶的抑菌環(huán)直徑22mm 頭孢曲松抑菌環(huán)直徑25mm 孢噻肟和氨曲南抑菌環(huán)直徑27mm 有一種藥敏紙片結果在此范圍均應高度懷疑為產(chǎn) ESBLs 株應進一步做確認試驗， 報告方式：疑似產(chǎn) ESBLs 株，所有的青霉素類、頭孢菌素類（包括三、 四代頭孢）單環(huán)酰胺類均視為耐藥； 方法的局限性 易漏檢,常規(guī)藥敏試驗：細菌對藥物MIC/直徑往往 可能落在敏感范圍，所以盡 可能檢測其耐藥機制,檢測ESBLS的意義,一旦診斷為產(chǎn)ESBLs所有的青霉

12、素類、頭孢菌素類（包括三、四代頭孢）單環(huán)酰胺類均視為耐藥，無論體外試驗是否敏感。,案例,患者，女，48歲，因尿頻、尿急、肉眼血尿收住本院干部病房，臨床診斷：尿路感染，給予三代頭孢，靜脈滴注一周，癥狀好轉(zhuǎn)出院。一周后復發(fā)，再次入院，治療同前，好轉(zhuǎn)出院，再次復發(fā)。 細菌培養(yǎng)：大腸埃希菌，產(chǎn)ESBL 敏感的抗生素：亞胺培南、頭孢西丁、呋喃妥因。 自購呋喃妥因治療后沒有復發(fā)。,頭孢菌素酶(AmpC酶) Bush酶,基本概念: 1、 AmpC酶又稱Bush酶，它的產(chǎn)生是由染色體上的AmpC基因所編碼產(chǎn)生; 2、分類屬Bush 型。 3、幾乎所有的革蘭陰性桿菌均可產(chǎn)生此酶，通常這種酶的表達水平很低，但在有

13、誘導劑存在時，酶的產(chǎn)生會大大增加（表達水平增加到10100倍），因此這類酶又叫誘導酶。,主要產(chǎn)酶菌株,綠膿桿菌 100% 吲哚陽性的變形桿菌 100%； 腸桿菌屬： 80%； 枸櫞酸桿菌屬： 80%； 沙雷菌屬： 80%； 沙門菌屬： 80%,產(chǎn)生機制：,誘導： 染色體AmpC基因通常處于關閉/抑制狀態(tài), AmpC 基因的編碼作用被AmpD基因所抑制，當AmpD基因發(fā)生去抑制突變時（去阻遏）抑制作用被解除， AmpC基因編碼產(chǎn)生高產(chǎn)AmpC酶。這個酶可以水解所有三代頭孢菌素，并且不被酶抑制劑所抑制。 內(nèi)酰胺類抗生素存在與環(huán)境中，與細菌細胞壁上的青霉素結合蛋白結合，PBPS 4、7a、7b被激活

14、,三個 PBPS被激活就可啟動AmpC基因，誘導AmpC酶表達?；罨蛩鼐褪强股?。,頭孢菌素酶(AmpC酶) Bush酶,誘導劑： 內(nèi)酰胺類抗生素 亞氨培南是潛在的酶誘導劑，但沒有去阻遏用；許多三代頭孢菌素是弱誘導劑，但有選擇去阻遏作用；,AmpC酶分類,1、染色體AmpC酶：（Bush 內(nèi)酰胺酶） 2、質(zhì)粒型AmpC酶： 近年來還發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導的AmpC酶。上述的AmpC基因活化結果有兩種表達： （1）可逆性 當去除誘導劑后，酶的表達水平將恢復到正常低基礎水平（體制性表達）。稱低產(chǎn)AmpC酶染色體介導。 （2）去阻遏 不可逆的，Amp基因活化是不可逆轉(zhuǎn)的即使停止使用藥物也仍然持續(xù)產(chǎn)生容易跳

15、到質(zhì)粒上稱持續(xù)高產(chǎn)AmpC酶。,分型及檢測方法略,檢測高產(chǎn)AmpC酶的意義,細菌一旦檢測為高產(chǎn)AmpC酶，提示為多重耐藥；對三代頭孢菌素、及含酶抑制劑的復合抗生素治療通常導致臨床治療失??； 應選用碳青霉希類或第四代頭孢或聯(lián)合喹諾酮類（氨基糖苷類）治療。,實驗室對同一患者相同部位檢出的同種病原菌，應每3-4天檢測抗生素敏感性，以監(jiān)測耐藥機制產(chǎn)生（三代頭孢SR，頭孢西丁S R） 專家系統(tǒng)藥敏評注,碳青霉烯水解酶,基本概念 ： 碳青霉烯水解酶是指所有能明顯水解碳青霉烯的內(nèi)酰胺酶，而不是單純的“碳青霉烯酶”。,碳青霉烯水解酶的發(fā)現(xiàn)及流行特點：,20世紀90年代初，日本發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導的金屬酶-IMP-1，

16、可在細菌之間轉(zhuǎn)移。 1996年日本17家醫(yī)院的研究中發(fā)現(xiàn)，0.4%的銅綠假單胞菌帶有IMP-1基因。 不久在意大利的一株鮑曼不動桿菌和新加坡的一株肺克菌中也發(fā)現(xiàn)了該類酶。 法國的一株銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導的金屬酶VIM-2，與意大利一株銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的VIM-1具有高度同源性，編碼VIM-1的基因位于轉(zhuǎn)座子上。 近年來由于產(chǎn)ESBLS和AmpC酶的菌株增多引起碳青霉烯類抗生素的臨床應用增加，可以預測世界其它地區(qū)亦可能出現(xiàn)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的流行。,什么是KPC酶？,國內(nèi)： 已在腸桿菌科的多個菌屬中有報道。 肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、沙門菌屬、弗勞地檸檬酸桿菌和

17、銅綠假單胞菌等。 該類酶除陰溝腸桿菌可有染色體介導外，其他各類細菌均可為質(zhì)粒介導，已成為臨床治療難題,碳青霉烯酶代表- KPC酶,碳青霉烯酶，分子分類法(Amblar)的A組絲氨酸酶、功能分類法(Bush)的2f組，主要由質(zhì)粒介導，其酶活性可受酶抑制劑抑制。 可導致細菌對碳青霉烯類、青霉素類、廣譜頭孢菌素及單環(huán)類等抗生素的耐藥性。 KPC-1KPC-4等4種。它們之間只有個別氨基酸發(fā)生了突變 KPC-1、美國、 1996年在一株對碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)，以后僅在幾年時間內(nèi)，已在美國、特別在美國的東北部各州蔓延，并造成局部地區(qū)暴發(fā)流行。,細菌一旦產(chǎn)生碳青霉烯酶臨床治療很困難,腸桿菌科

18、細菌耐藥機制,ESBLs 質(zhì)粒型AmpC酶 KPC 碳青霉烯酶,腸桿菌科細菌中的KPC 碳青霉烯酶,可以水解碳青霉烯類 (imipenem,ertapenem ertapenem, meropenem, doripenem). 主要發(fā)生在美國東部醫(yī)院的ICU病房. 肺炎克雷伯菌和其他的腸桿菌科細菌. 常規(guī)的藥敏試驗方法不易檢出，碳青霉烯類對這些細菌的MIC往往 2 g/ml (仍然是敏感的) KPC 酶可以水解廣譜頭孢菌素 ，因此所有對具有產(chǎn)ESBL酶的腸桿菌科細菌應該篩選碳青霉烯酶,如何檢測碳青霉烯酶？,產(chǎn)KPC酶的菌株用常規(guī)藥敏試驗不容易檢出。 可將厄他培南列為常規(guī)藥敏試驗的品種 對所有具

19、有ESBLs/AmpC酶樣表型（即對第三、第四代頭孢菌素耐藥）的腸桿菌科細菌采用紙片法或MIC法（E-試驗）進行厄他培南（和其他碳青霉烯類）的測定。 如MIC為2或4g/ml應視作有產(chǎn)KPC酶和其他碳青酶霉烯酶的可能。 這時應與臨床醫(yī)師聯(lián)系，并將該菌株送往參考試驗室作進一步的研究。 改良的 Hodge test PCR 測定 KPC酶,泛耐菌和多重耐藥,泛耐菌: 如果該細菌對第3和4代頭孢菌素,含酶抑制劑的復方制劑,碳青酶烯類,氟喹諾銅類和氨基塘甙類均耐藥,但對多粘菌素敏感為泛耐菌. 多重耐藥菌: 對5類藥物中的一類或幾類耐藥為多重耐藥菌.,臨床常用抗菌藥物,-內(nèi)酰胺類抗生素 糖肽類-萬古霉素

20、、去甲萬古霉素、替考拉寧 氨基糖苷類 大環(huán)內(nèi)酯類 喹諾酮類藥物 其它抗菌藥-物磷霉素、多黏菌素鏈陽菌素等，抗真菌藥,泛耐藥菌株（Pan drug Resistant Strains）,細菌：鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌 對常規(guī)藥敏試驗的藥物均耐藥 哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、氨曲南、環(huán)丙沙星、阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南強力霉素和SMZ-TMP 采取哪些措施 菌株重新鑒定 試驗其它藥物：多粘菌素/粘菌素 敏感性試驗或協(xié)同試驗,綠膿桿菌耐藥機制,膜通透性下降 高產(chǎn)ampC酶; 產(chǎn)ESBL; 產(chǎn)金屬酶 泵出機制 生物膜,銅綠假單孢菌,銅綠假單胞菌的細胞外膜上沒

21、有大多數(shù)革蘭陰性細菌所具有的典型的高滲透性孔蛋白，它的孔蛋白通道對小分子物質(zhì)的滲透速度僅為典型孔蛋白通道的1%。,不動桿菌的耐藥機制,對多種窄譜內(nèi)酰胺酶耐藥由于TEM1和CARB型內(nèi)酰胺酶 對新型三代頭孢菌素耐藥是因為產(chǎn)大量染色體頭孢菌素酶和超廣譜的TEM酶,不動桿中最主要的碳青霉烯酶是D類酶 OXA-23、24、25、26、27、40、49、51、 54、55、58、60 該酶能水解亞胺培南、青霉素，但不水解三代頭孢菌素.,不動桿菌主要耐藥機制,不動桿菌中還產(chǎn)IMP或VIM型金屬酶，該酶水解底物范圍廣，包括碳青霉烯類、青霉素類和頭孢菌素抗生素，不被克拉維酸等酶抑制劑抑制，但能被EDTA、2-

22、巰基丙酸抑制,革蘭陰性菌 革蘭陽性菌 ESBLs MRSA AmpC VISA與VRSA KPC VRE PRSP 耐藥菌、細菌泛耐和多重耐藥的監(jiān)測工作必須靠臨床醫(yī)護人員和微生物檢驗工作人員攜手，才能做好-加強溝通,小結,1細菌耐藥性產(chǎn)生是必然性、預防性 2細菌的耐藥機制多樣性、常見的耐藥機制 3針對耐藥性最好的治療方法個體化治療 4加強臨床與實驗室溝通非常重要,案例1,臨床 患者： 楊 x x 、 男 43歲 、住院號 7757492 主訴：發(fā)熱8天伴頭痛 入院時間：2008年2月18日5pm 入院體溫：39 入院診斷：發(fā)熱原因待查？ 入院檢查: WBC 3.2X109/L2.4X109/L, HB 140G/L 109G/L NEU 52.5%, LY 33