原核基因表達調控1.ppt

1、7.3 色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng),色氨酸操縱子的轉錄調控包括： （1）阻遏系統(tǒng) （2）弱化系統(tǒng),色氨酸操縱子的結構 調控基因 結構基因 催化分枝酸轉變?yōu)樯彼?的酶,trpR,trp,特點: (1) trpR和trpABCDE不連鎖； (2) 操縱基因在啟動子內 (3) 有衰減子(attenuator)/弱化子 (4) 啟動子和結構基因不直接相連，二者被 前導序列(Leader)所隔開,7.3.1 色氨酸操縱子的阻遏系統(tǒng),1.色氨酸操縱子(tryptophane operon) 負責色氨酸的生物合成。當培養(yǎng)基中有足夠的色氨酸時，這個操縱子自動關閉，缺乏色氨酸時操縱子被打開，trp基因表達，色

2、氨酸或與其代謝有關的某種物質在阻遏過程中起作用。 這個系統(tǒng)的效應物是色氨酸，是try操縱子所編碼的生物合成途徑的末端終產物。,2. 色氨酸的合成,色氨酸的合成分5步完成。每個環(huán)節(jié)需要一種酶，編碼這5種酶的基因緊密連鎖在一起，被轉錄在一條多順反子mRNA上，分別以 trpE-鄰氨基苯甲酸合成酶 trpD-鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉移酶 trpC-鄰氨基苯甲酸異構酶 trpB-色氨酸合成酶 trpA-吲哚甘油-3-磷酶合成酶,細菌中的色氨酸生物合成途徑,3.色氨酸操縱子(trp)結構,包括: 調節(jié)基因（R） 啟動子 （P） 操縱基因（O） 引導序列（L）及弱化子a 結構基因（E、D、C、B、A）,大腸桿

3、菌中的色氨酸操縱子,大腸桿菌中的色氨酸操縱子組成和功能,trp 操縱子O的結構,trp 操縱子的阻遏系統(tǒng),低Trp時： 阻遏物不結合操縱基因; 高Trp時： 阻遏物+Trp 結合操縱基因,7.3.2 弱化子與前導肽,1.弱化子 ：在負控阻遏系統(tǒng)調節(jié)的基因中，起終止轉錄信號作用的一段核苷酸片段，稱為弱化子。 DNA中可導致轉錄過早終止的一段核甘酸序列（123-150區(qū)）。 弱化子調控是轉錄調控中的微調控（或細調控）。在這個系統(tǒng)中，酶的濃度根據(jù)氨基酸濃度的變化而受調節(jié)。,弱化子,123150,2. 前導肽與前導序列,前導肽是前導序列產生的一個含14個氨基酸的多肽。 前導肽對應的mRNA序列為前導序

4、列。 前導序列在trp mRNA5/端trpE基因的起始密碼前有一段長162bp的片段，稱為前導區(qū)。,前導序列和前導肽結構,3. mRNA前導區(qū)分析,前導序列結構特點 易形成莖環(huán)結構，有8個U的終止信號序列 1和2區(qū)形成第二個發(fā)夾結構 3和2也形成發(fā)夾結構 有前導肽 有二個相鄰色氨酸密碼子（UGGUGG),前導序列：在trp mRNA5端trpE基因的起始密碼前一個長162bp的mRNA片段。,前導序列的二級結構與衰減子構象,第1種構象：較穩(wěn)定構象，在離體條件下存在。 特征：1區(qū)和2區(qū)配對； 3區(qū)和4區(qū)配對，為衰減子構象。 此種構象的衰減子使后面轉錄提前結束。 第2種構象：在細胞內和離體均存在

5、。 特征：2區(qū)和3區(qū)配對； 此種構象可RNA聚合酶繼續(xù)轉錄。,前導序列二級結構,前導序列 二級結構與衰減子構象,4.轉錄的弱化作用-衰化機制,（1）trp饑餓-抗衰減作用，即轉錄繼續(xù)進行。 當無色氨酸存在時，核糖體在1區(qū)內的trp密碼子位置停頓相當長時間，1區(qū)處于核糖體覆蓋之下，不能同2區(qū)作堿基配對。但2區(qū)和3區(qū)就可以有堿基配對，迫使4區(qū)處于單鏈形式，不能形成二級結構的終止信號，結果RNA聚合酶就穿過衰減子區(qū)繼續(xù)轉錄進程。,trp饑餓-抗衰減作用,（2）非trp饑餓-轉錄終止 當有色氨酸存在時，核糖體能合成前導肽。核糖體伸展到2區(qū)，阻礙1區(qū)與2區(qū)的堿基配對，但3區(qū)和4區(qū)可以進行堿基配對，產生終

6、止信號，結果RNA聚合酶就在衰減子區(qū)停止轉錄。,非trp饑餓-轉錄終止,弱化子的弱化作用機制,前導肽,轉錄終止結構,小結： trp操縱子弱化機制,7.3.3 trp操縱子弱化機制的實驗證據(jù),研究方法： 前導區(qū)的調節(jié)作用證據(jù),細菌中為什么要有弱化子系統(tǒng)呢？一種可能是阻遏物從有活性向無活性的轉變速度極低，需要有一個能更快地做出反應的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當?shù)纳彼崴健；蛘撸趸酉到y(tǒng)主要是對外源色氨酸濃度做出反應。外源色氨酸濃度很低的信號雖然足以引起trp操縱子的去阻遏作用，但是這個信號還不足以很快引發(fā)內源色氨酸的合成。在這種環(huán)境下，弱化子就通過抗終止的方法來增加trp基因表達，從而提高內源色氨

7、酸濃度。 那么為什么還要有阻遏體系呢？ 目前認為阻遏物的作用是當有大量外源色氨酸存在時，阻止非必需的先導mRNA的合成，它使這個合成系統(tǒng)更加經濟!,總結！ trp操縱子調控,trp操縱子調控方式： 1、粗調控-阻遏作用 即啟動子-操縱基因系統(tǒng)受阻遏蛋白的負調控 。信號是細胞內的色氨酸的多少。 2、細調控-弱化作用 核糖體對mRNA前導序列L中弱化子的結合對轉錄終止進行調控。信號是細胞內載有色氨酸的tRNA的多少。,其它氨基酸饑餓對trp弱化子的作用,1、甘氨酸饑餓時，核糖體停留在前導序列的甘氨酸密碼子GGU上， trp操縱子不能表達。 2、蘇氨酸饑餓時，核糖體停留在前導序列的甘氨酸密碼子AUC

8、上， trp操縱子不表達。 3、精氨酸缺乏時，與trp饑餓相同，RNA聚合酶可以繼續(xù)轉錄。,衰減作用的普遍性,存在衰減作用的調控十分普遍。 大腸桿菌的trp、val、phe、thr、leu； 沙門氏菌的his、leu、嘧啶合成等；,7.3.4 trp操縱子的其他調控機制,大腸桿菌trp操縱子與枯草埃希菌trp操縱子比較,7.4 其他操縱子,7.4.1半乳糖操縱子(galactose operon),異構酶(galE) 乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉移酶(galT)半乳糖激酶(galk)。,7.4 其他操縱子的調控機制,7.4.1 半乳糖操縱子 大腸桿菌半乳糖操縱子(galactose operon)包

9、括3個結構基因： 異構酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)，半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉移酶(galactose transferase, galT)， 半乳糖激酶(galactose kinase, galk)。 這3個酶的作用是使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。GalR與galE、T、K及操縱區(qū)O等離得很遠，而galR產物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同。,gal操縱子,gal操縱子lac操縱子ara操縱子比較,gal操縱子的特點： 它有兩個啟動子，其mRNA可從兩個不同的起始點開始轉錄； 它有兩個O區(qū)，一個在P區(qū)上游-67-53，另一個在結構基因galE

10、內部。,7.4.2 阿拉伯糖操縱子 阿拉伯糖(arabinose)是另一個可以為代謝提供碳源的五碳糖。 在大腸桿菌中阿拉伯糖的降解需要3個基因：araB、araA和araD，分別編碼3個酶： araB基因編碼核酮糖激酶(ribulokinase)， araA編碼L-阿拉伯糖異構酶(L-arabinose isomerase)， araD編碼L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構酶(L-ribulose-5phosphate-4epimerase)。 與araBAD相鄰的是一個復合的啟動子區(qū)域和一個調節(jié)基因araC，這個AraC蛋白同時顯示正、負調節(jié)因子的功能。AraBAD和araC基因的轉錄是分別

11、在兩條鏈上以相反的方向進行的。在標準的遺傳學圖譜上，araBAD基因簇從啟動子PBAD開始向左進行轉錄，而araC基因則是從Pc向右轉錄。,ara操縱子的調控有兩個特點： 第一，araC表達受到AraC的自身調控。 第二，AraC既是ara操縱子的正調節(jié)蛋白（需cAMP-CRP的共同參與，起始轉錄），又是其負調節(jié)蛋白。這種雙重功能是通過AraC蛋白的兩種異構體來實現(xiàn)的（Pi和Pr)。,1. AraC蛋白的正負調節(jié)作用,AraC蛋白作為PBAD活性正、負調節(jié)因子的雙重功能是通過該蛋白的兩種異構體來實現(xiàn)的。 Pr是起阻遏作用的形式，可以與現(xiàn)在尚未鑒定的類操縱區(qū)位點相結合， 而Pj是起誘導作用的形式

12、，它通過與PBAD啟動子結合進行調節(jié)。 在沒有阿拉伯糖時，Pr形式占優(yōu)勢；一旦有阿拉伯糖存在，它就能夠與AraC蛋白結合，使平衡趨向于Pi形式。這樣，阿拉伯糖的誘導作用就可以解釋為阿拉伯糖與Pr的結合，使Pr離開它的結合位點，然后，產生大量的Pi，并與啟動子結合。,2. AraC蛋白的兩種形式,3. 營養(yǎng)狀況對ara操作子的影響,7.4.3 阻遏蛋白LexA的降解與細菌中的SOS應答,SOS反應的機理： 由 RecA 蛋白和 LexA 阻遏物的相互作用引起的。 LexA阻遏物：是SOS DNA修復系統(tǒng)所有基因的阻遏物 RecA蛋白：是SOS反應的最初的發(fā)動因子。在單鏈DNA和ATP存在時，Re

13、cA蛋白被激活，表現(xiàn)出水解酶活性，分解LexA阻遏物。 當RecA水解LexA阻遏物后，導致SOS體系（包括recA基因）高效表達，DNA得到修復,7.4.4 二組分調控系統(tǒng)與信號傳導,二組分調控系統(tǒng)： 由兩種不同蛋白質組成。 （1）膜上傳感蛋白； （2）細胞質中的應答調節(jié)蛋白；,7.4.5 多啟動子調控的操縱子,I rRNA操縱子大腸桿菌rRNA操縱子（rrnE）上有兩個啟動子，P1和P2。P1是強啟動子，營養(yǎng)充沛時，由P1起始的轉錄產物比由P2起始的轉錄產物高3-5倍。當營養(yǎng)匱乏時，P1的作用被抑制，但P2仍有功能。,II. 核糖體蛋白SI操縱子核糖體蛋白SI操縱子（rpsA），它也受應急

14、反應調節(jié)。RpsA有4個啟動子，P1、P2是強啟動子，平時主要依靠它們來啟動基因的表達，合成SI蛋白。P3、P4是弱啟動子，只有在緊急情況下，P1、P2啟動子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的SI蛋白維持了生命的最低需要。,III. Dna Q蛋白操縱子 Dna Q蛋白是DNA聚合酶全酶的亞基之一，其主要功能是校正DNA復制中可能出現(xiàn)的錯誤。在RNA聚合酶活性較低時，操縱子的轉錄由弱啟動子P2控制；而RNA聚合酶活性較高時，就開始利用強啟動子P1。,7.5 固氮基因調控（自學）,7.6 轉錄水平上的其他調控方式,轉錄過程的調控是生物基因表達調節(jié)最有效的方式，體現(xiàn)在任一過程。 轉錄起始階

15、段的調控包括： 不同因子的選擇性使用，操縱子調控。,7.6.1 因子的調節(jié)作用,因子的調節(jié)作用：獨立作用和交互作用 因子活性調控： 1、被蛋白水解酶的調控 2、能被同源的抗因子失活，阻止與RNA聚合酶核心酶組裝 舉例：革蘭氏陽性菌形成孢子-4種因子 P270圖,7.6.2 組蛋白類似蛋白的調控作用,細菌體內的非特異性DNA結合蛋白是：組蛋白類似蛋白 舉例：細菌的H-NS蛋白-結構特點： 2個結構域：DNA結合結構域，蛋白-蛋白相互作用結構域。 作用： 1、維持DNA的高級結構，形成多聚體； 2、可與大腸桿菌基因組上大量分散基因調控區(qū)結合，抑制基因轉錄。,7.6.3 轉錄調控因子的作用,轉錄調控

16、因子是指能夠與基因的啟動子區(qū)相結合，對基因的轉錄起激活或抑制作用的DNA結合蛋白。 大多數(shù)是序列特異性結合蛋白。 作用：有的能調控大量基因的表達，有的僅調控1-2個基因的表達。 舉例：轉錄調控因子CRP、ArcA調控50%的表達；也有60個轉錄因子調控2個啟動子；,7.6.4 抗終止因子的調控作用,抗終止因子是能夠在特定位點阻止轉錄終止的一類蛋白質。 當這些存在時，RNA聚合酶能夠越過終止子，繼續(xù)轉錄DNA。 這種調控主要在噬菌體和少數(shù)細菌中，當RNA聚合酶到終止子之前與RNA聚合酶結合，只有與抗終止因子結合的RNA聚合酶才能順利通過具有莖環(huán)結構的終止子，使轉錄繼續(xù)進行。 P271圖 舉例：大

17、腸桿菌的抗終止子的蛋白：Nus蛋白 轉錄的起始和終止過程中， RNA聚合酶分別受到因子和NusA蛋白的調控。,7.7.1 mRNA自身結構元件對翻譯起始的調節(jié) 7.7.2 mRNA穩(wěn)定性對轉錄水平的影響 7.7.3 調節(jié)蛋白的調節(jié)作用 7.7.4 反義RNA的調節(jié)作用,7.7 轉錄后調控,7.7.1 mRNA自身結構元件對翻譯Q起始的調節(jié),1、翻譯起始于核糖體的30S亞基對mRNA上起始密碼的識別。AUG的識別有fMet-t RNA中的UAC完成配對。 原核生物的起始密碼子使用 AUG 常用 GUG 14%，與fMet-t RNA中的UAC配對弱 UUG 3%，與fMet-t RNA中的UAC

18、配對弱 AUU,2、 mRNA上的核糖體結合位點（RBS)與SD序列結合強度及起始密碼AUG的距離。 SD與AUG之間距離4-10個核苷酸，9個最佳。 3、 mRNA的二級結構對翻譯起始的調控。 SD序列的微小變化影響mRNA的二級結構。,7.7.2. mRNA穩(wěn)定性對轉錄水平的影響,細菌的mRNA半衰期2-3分鐘。 mRNA的降解取決于二級結構。 舉例：大腸桿菌的CsrAB系統(tǒng) CsrA是RNA結合蛋白， CsrB是非編碼的RNA分子。,7.7.3 調節(jié)蛋白的調節(jié)作用,mRNA上的結合蛋白和特異性抑制蛋白，可通過與核糖體的競爭性結合來抑制翻譯起始。 舉例：大腸桿菌中核糖體蛋白 P274圖,7

19、.7.4 反義RNA的調節(jié)作用,RNA調節(jié)是原核生物基因表達轉錄后調節(jié)的重要機制。 細菌受環(huán)境影響會產生一宿非編碼的小RNA。 小RNA作用：能與mRNA上特定序列結合配對并改變mRNA的構象，導致翻譯被開啟貨關閉，也可能導致目標mRNA快速降解。 舉例：細菌鐵蛋白,7.7.5稀有密碼子對翻譯的影響,大腸桿菌DNA聚合酶的RNA引物,dnaG(引物酶) RNA引物,dnaG、rpoD和rpsU屬于大腸桿菌基因組上的同一個操縱子,細胞需要數(shù)量： 50個拷貝的dnaG蛋白、2800個拷貝的rpoD和40000個拷貝的rpsU,幾種蛋白質中異亮氨酸密碼子使用頻率比較,結論： 細胞內對應于稀有密碼子的

20、tRNA較少，高頻率使用這些密碼子的基因翻譯過程容易受阻，影響了蛋白質合成的總量。,7.7.6 重疊基因對翻譯的影響 重疊基因最早在大腸桿菌噬菌體X174中發(fā)現(xiàn)，用不同的閱讀方式得到不同的蛋白質，絲狀RNA噬菌體、線粒體DNA和細菌染色體上都有重疊基因存在。 Trp操縱子由5個基因（trpE、D、C、B、A）組成，在正常情況下，操縱子中5個基因產物是等量的，但trpE突變后，其鄰近的trpD產量比下游的trpBA產量要低得多。這種與蛋白無關的表達調控，已被證實是在翻譯水平上的調控。,大腸桿菌噬菌體X174重疊基因對翻譯的影響,TrpB 谷氨酸- 異亮氨酸-終止 GAA - AUC - UGA - UGG - AA AUG - GAA 甲硫氨酸 谷氨酸t(yī)rpA,trpE蘇