SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳標準操作規(guī)程(12%膠)

1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳標準操作規(guī)程（12%膠， 14.4-97KD ）1 電泳各試劑的配制1.1 凝膠貯液： Acrylamide/Bis (30%T， 2.67%C)為聚丙烯酰胺取丙烯酰胺acrylamide29.2 g、雙丙烯酰胺N N -bis-methylene-acrylamide0.8 g至 100mL量瓶中，加去離子水至刻度，搖勻，過濾。4避光儲存。1.2即 10%的過硫酸銨10%APS（臨用現(xiàn)配）稱取過硫酸銨（ammonium persulfate） 100 mg，加1mL去離子水溶解。1.5M Tris-HCl， pH 8.8稱取Tris base 18.15g 于量瓶中

2、，加去離子水80mL，用HCl調(diào)節(jié)pH 8.8，再加去離子水至總體積100mL。 4儲存。0.5%（ w/v ）溴酚藍：溴酚藍0.5g ，去離子水定容至100mL。0.5M Tris-HCl水 60mL，用 HCl， pH 6.8調(diào)節(jié) pH 6.8：稱取 Tris（三羥甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去離子，再加去離子水至總體積100mL。 4儲存。10%（ w/v ） SDS：稱取 10g SDS至 100ml 量瓶中，加90ml 去離子水，緩慢攪拌至溶解，再加去離子水至刻度。1.3凝膠配制按下表比例配制凝膠Acr/Bis （30%）1.5M Tris-HCl0.5M水 /mL，10%SD

3、S/mL/mLpH 8.8/mLTris-HCl ， pH6.8/mL12%分離膠3.44.02.50.15%濃縮膠5.71.72.50.1分離膠及濃縮膠按上表比例配好后，均需脫氣10%APS及 10 l TEMED；往濃縮膠中加入15 min。臨灌膠前，往分離膠中加入100 l100 l 10%APS及 20 lTEMED（各試劑按比例增減）。其中：TEMED為催化劑1.410電極緩沖液，pH 8.3稱取 Tris base 30.3 g 、Glycine （甘氨酸） 144 g 、 SDS 10.0 g 溶解，加去離子水至刻度，不調(diào) pH。 4儲存。臨用前，取出放至室溫，于 1000 mL

4、 量瓶中，10 倍稀釋，混勻，即為電極緩沖液。1.5樣品溶解液S去離子水3.55mL；0.5M Tris-HCl， pH 6.81.25mL ；glycerol（甘油 ）2.5mL10% (w/v) SDS2.0mL0.5%（ w/v）溴酚藍0.2mL總體積為9.5 mL 。室溫儲存。臨用前加 50 l - 巰基乙醇（ -Mercaptoethanol）于 950l 樣品緩沖中，即為樣品溶解液。2染色各試劑的配制2.1固定液：50%乙醇， 12%冰醋酸， 0.1%甲醛（即 250ml 無水乙醇 +60ml 冰醋酸 +0.5ml甲醛 +去離子水至 500ml）2.2洗滌液： 50%乙醇（ 500

5、ml 無水乙醇 +500ml 去離子水）2.3敏化液： 0.02%無水硫代硫酸鈉（ 62.78mg 五水硫代硫酸鈉，加去離子水定容至200ml）2.4染色液： 0.5% 硝酸銀， 0.075%甲醛（臨用現(xiàn)加） （ 0.5g 硝酸銀 +100ml 去離子水 +197ul甲醛）甲醛臨用現(xiàn)加2.5 顯色液： 6%無水碳酸鈉， 0.0004%硫代硫酸鈉， 0.05%甲醛（臨用現(xiàn)加） （即 60g 無水碳酸鈉 +6.28mg 五水硫代硫酸鈉 +去離子水至 1000ml 作為顯色貯備液， 每次用時取 100ml+132ul甲醛即得）2.6終止液： 50%乙醇， 12%冰醋酸（ 250ml 無水乙醇 +60

6、ml 冰醋酸 +去離子水至500ml 即為終止液）以上均用去離子水配制。3 針晶提取3.1取新鮮天南星科藥材，去皮。3.22切碎至約 3 mm。3.3將已切碎的藥材置于大小適宜的潔凈研缽中，加入2 倍體積石油醚（ 6090）研磨，每次約 510 min ，反復多次。3.4將石油醚溶液倒出，經(jīng)4 層醫(yī)用紗布過濾，合并濾液，用孔徑0.22 m的偏氟膜抽濾，得濾餅。3.5取濾餅適量于離心管中，加入 30 倍體積的四氯化碳， 混勻，8000 rpm 離心 3min（三樓），去除四氯化碳液，反復3 次。3.6離心后的下層沉淀中加入石油醚（6090）適量，混勻，用孔徑0.22 m的偏氟膜過濾，得濾渣，即為

7、毒針晶蛋白純化的樣品。4 實驗步驟4.1樣品制備 精密稱取半夏及其它樣品純化毒針晶蛋白適量，分別以移液槍加入樣品溶解液，使?jié)舛葹?30 l/mg 混勻（，將各樣品液及未預染標準蛋白于沸水浴中加熱5 min后，置于高速離心機中，10000 rpm 離心 3 min （五樓）。4.2上樣 精密吸取各樣品液10 l 、標準蛋白液 5 l ，按電泳儀使用說明中的上樣方法上樣。4.3 電泳設置電流強度為：濃縮膠10 mA、分離膠16 mA。4.4 固定將膠從玻璃板中取出，切角標記。放置適宜容器內(nèi)，以固定液固定，平穩(wěn)放置搖床上，室溫下固定 1 h 以上。4.5清洗 將固定液傾倒出，加入洗滌液，反復洗滌3 次，每次 5 min 。4.6敏化 將洗滌液傾倒出，加入敏化液，敏化1min。4.7清洗 將敏化液傾倒出，加入去離子水，反復洗滌3 次，每次 1 min 。4.8染色 將去離子水傾倒出，加入染色液，避光染色20 min 。4.9清洗 將染色液倒出，加入去離子水，反復洗滌3 次，每次 1 min 。4.10顯色 將去離子水倒出，加入顯色液，先蕩洗片刻后除去， 再次加入顯色液， 注意觀察，至顯示清晰條帶即可停止顯色。4.11終止顯色 當膠上呈現(xiàn)出清晰地蛋白條帶，即將膠取出， 放入終止液中， 終止顯色 10min