偽狂犬病活疫苗

1、 偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生產(chǎn)工藝規(guī)程編制人： 年 月 日審核人： 年 月 日 批準人： 年 月 日目 錄一、目 的：偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生產(chǎn)工藝規(guī)程的方法和程序。二、適用范圍：適用于偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生產(chǎn)的全過程三、依 據(jù)：偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及檢驗試行規(guī)程四、責(zé) 任 者：生產(chǎn)車間、質(zhì)管部。五、正 文：工藝流程及質(zhì)量控制要點 操作細則1、制苗材料的制備2、生產(chǎn)用種毒的制備3、半成品的配制4、配苗5、疫苗的分裝6、疫苗的凍干7、軋蓋貼標8、包裝 成品檢驗 工藝衛(wèi)生與人員衛(wèi)生 生產(chǎn)設(shè)備一覽表 包裝機檢查方法 物料

2、平衡 勞動定員及勞動保護吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件題 目偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生產(chǎn)工藝規(guī)程 編 碼：SOP-SC- -共 13 頁制 定審 核批 準制定日期審核日期批準日期頒發(fā)部門辦公室頒發(fā)數(shù)量生效日期分發(fā)單位辦公室、生產(chǎn)技術(shù)部、質(zhì)管部一、目 的：規(guī)定制造偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的方法和程序。二、適用范圍：適用于偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生產(chǎn)的全過程三、依 據(jù)：偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及檢驗試行規(guī)程四、責(zé) 任 者：生產(chǎn)車間、質(zhì)管部。五、正 文：【品 名】偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）【質(zhì)量標準】本企業(yè)偽

3、狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）質(zhì)量標準【外 觀】本品為淡黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解?！疽?guī) 格】10頭份/瓶、20頭份/瓶、70頭份/瓶【儲 藏】在-15以下，有效期暫定為18個月【作用與用途】用于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征。免疫期為4個月。 【用法與用量】1 按瓶簽注明的頭份加生理鹽水稀釋，耳根后部肌肉注射。2 仔豬斷奶前免疫1次，1頭份/頭。3 母豬配種前免疫1次，1頭份/頭。【成品代碼】C【批 量】40000瓶I 工藝流程及質(zhì)量控制要點種 毒 制 備雞胚成纖維細胞制及檢驗備接 種旋 轉(zhuǎn) 培 養(yǎng)收 獲 半成品檢驗合 格不 合 格配 苗無害化處理軋蓋貼標包裝入

4、 待 檢 庫成 品 檢 驗不合格入報廢品庫銷 售無 害 化 處 理合格入成品庫分 裝凍 干偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）質(zhì)量控制要點工 序質(zhì)量控制要點質(zhì)量控制項目頻次毒種制備種 毒無菌檢驗每批病毒含量每批細胞制備消 化時間、溫度每批細 胞外源病毒檢驗每批毒液制備接 種接 種 量每批觀 察細胞再生狀況每批半成品檢驗無菌檢驗每批病毒含量每批配 苗半成品、保護劑無菌檢驗每批配苗比例每批分 裝分裝過程無菌檢驗分裝過程中前、中、后檢驗分 裝 量間隔半小時標定分裝量凍 干凍干曲線共融點、真空度每批成品檢驗成 品理化指標每 批無菌檢驗每 批鑒別檢驗每 批效力檢驗每 批安全檢驗每 批外源病毒檢驗每

5、批支原體檢驗每 批II 操作細則本品系用偽狂犬病病毒弱毒株接種于雞胚成纖維細胞收獲感染病毒液，加適宜穩(wěn)定劑，經(jīng)冷凍干燥制成，用于預(yù)防豬、牛及綿羊偽狂犬病。1 制苗材料的制備1.1 條件準備1.1.1 根據(jù)細胞制備所需物品及設(shè)備條件，進行全面準備。1.1.2 按使用時間，提前做好滅菌工作后將準備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。1.1.3 在工作開始前3040min，按凈化級別要求調(diào)整送風(fēng)量，達到潔凈級別要求。1.2 操作規(guī)則1.2.1 細胞的制備1.2.1.1 制苗用細胞的來源發(fā)育良好的910日齡SPF雞胚。1.2.1.2 細胞制備選擇910日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，先用碘酒棉消毒蛋殼氣室部

6、位，無菌取出雞胚，去頭、四肢和內(nèi)臟，放入滅菌的玻璃器皿中，用漢克氏液洗滌胚體，用滅菌剪刀剪成米粒大小的組織塊，再用漢克氏液洗滌23次，然后加0.25%胰酶溶液（每胚4ml），37.538.5消化2030分鐘，吸出胰酶溶液，用漢克氏液洗滌23次再加入適量的營養(yǎng)液（用含5%10%犢牛血清乳漢液，加適宜的抗生素適量）吹打，用46層紗布過濾，制成每1ml含活細胞數(shù)約100150萬的細胞懸液，分裝于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，形成單層后備用。 細胞培養(yǎng)物應(yīng)無細菌、霉菌（見無菌（純粹）檢驗標準操作規(guī)程）和支原體（見支原體檢驗標準操作規(guī)程）污染，無特異性病變。 將細胞凍融液接種Marc-145細胞，應(yīng)不出現(xiàn)任何病變（

7、見外源病毒檢測標準操作規(guī)程）。1.3 清場和記錄1.3.1 工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場，對工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進行處理。 1.3.2 全面填寫生產(chǎn)工序記錄。2 生產(chǎn)用毒種的制備2.1 條件準備 2.1.1 根據(jù)毒種制備所需物料及設(shè)備條件，進行全面準備。 2.1.2 按使用時間，將準備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。 2.1.3 在工作開始前3040min，按凈化級別要求調(diào)整送風(fēng)量，達到潔凈級別要求。 2.2 操作規(guī)則 2.2.1 制苗用病毒液的制備2.2.2.1 細胞單層培養(yǎng) 將擴大培養(yǎng)的種子細胞接種到轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，控制轉(zhuǎn)速912轉(zhuǎn)/小時。2.2.1.2 接種

8、取所需數(shù)量的、細胞覆蓋率達到80%以上的細胞轉(zhuǎn)瓶，棄去生長液，按2（V/V）接種病毒，加入含2%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，37C旋轉(zhuǎn)（912轉(zhuǎn)/小時）培養(yǎng)。2.2.1.3收獲 在顯微鏡下觀察由病毒引起的細胞病變（CPE），直至CPE達到70%以上收獲細胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融1次，經(jīng)離心或過濾除去細胞碎片，凍存于-40C以下。2.2.2 毒種鑒定2.2.2.1 弱毒標準2.2.2.2病毒含量 將毒種用無血清培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-74個稀釋度，分別接種于96孔細胞板，每個稀釋度接種6孔，每孔0.1mL，設(shè)置正常的細胞對找孔，放置5%CO2，37下培養(yǎng)觀察35日，根據(jù)

9、Reed-Muench法計算TCID50。病毒含量應(yīng)107.0TCID50。2.2.2.3 鑒別檢驗中和試驗：將毒種用無血清培養(yǎng)基稀釋成103TCID50/mL，取0.1mL與等量呼吸綜合征病毒特異性陽性血清混合，同時設(shè)病毒對照組和正常細胞對照組，37作用1小時后，接種Marc-145細胞培養(yǎng)板，觀察5日。應(yīng)不產(chǎn)生細胞病變（CPE）。1.2.2.2 病毒基因鑒定 應(yīng)用下列引物進行RT-PCR檢測，毒種可擴增出581bp的特異性條帶，以而豬繁殖與呼吸綜合征病毒NVDC-JXA1-R株為代表的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒以及其他豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸為陰性（豬繁殖與呼吸綜合征病毒 JXA1-

10、R株RT-PCR檢測方法見附注3）。U1 ATTTGAATGTTCGCACGGTCTCD2 CGGAACCATCAAGCACAACTCT2.2.2.4 毒力對仔豬的毒力 用JXA1-R-R株毒種（106.0TCID50/mL）接種46周齡抗原豬繁殖與呼吸綜合征病毒、抗體陰性仔豬（陰性豬標準見附注1）5頭，每頭頸部肌肉注射2mL，同時設(shè)5頭陰性豬作對照，隔離飼養(yǎng)。接種豬逐日測量體溫，觀察臨床癥狀，均不發(fā)病（發(fā)病豬判定標準見附注2）。對妊娠母豬的毒力 用JXA1-R-R株毒種（106.0TCID50/mL）接種懷孕8090天的母豬3頭，每頭頸部肌肉注射2mL，同時設(shè)同期懷孕母豬3頭做對照，隔離飼養(yǎng)

11、，觀察母豬臨床癥狀和分娩產(chǎn)仔狀況。懷孕母豬應(yīng)不發(fā)生流產(chǎn)，所產(chǎn)仔豬的存活率與未接種對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。2.2.2.5 免疫原性 取46周齡豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、抗體陰性豬（陰性豬標準見附注1）10頭，其中5頭肌肉注射JXA1-R-R株毒種2mL（105.0TCID50/mL），另5頭作為對照，同條件下隔離飼養(yǎng)。28日后，所有豬肌肉注射檢驗用強毒NVDC -JXA1株病毒培養(yǎng)液（病毒含量104.5TCID50/mL）3mL，每天測溫并觀察21日。對照豬均應(yīng)發(fā)病，且至少2頭死亡，免疫豬應(yīng)至少4頭保護（發(fā)病豬判定標準見附注）。2.2.2.6 純凈 按現(xiàn)行中國獸藥典進行檢驗，應(yīng)無細菌、霉菌、支原體

12、和外源病毒污染。2.2.3 基礎(chǔ)種子代數(shù)8290代。2.2.4 種毒保存 -70下，保存期暫定為12個月。2.2.5 強毒標準2.2.5.1 病毒含量 將毒種用無血清培養(yǎng)基做10倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-64個稀釋度，分別接種于96孔細胞板，每個稀釋度接種6孔，每孔0.1mL，在37下培養(yǎng)觀察57日，根據(jù)Reed-Muench法計算TCID50。病毒含量應(yīng)105.5TCID50/mL。2.2.5.2 對豬的毒力 取810周齡的豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原抗體陰性豬（陰性豬標準見附注1）5頭，每頭豬肌肉注射檢驗用強毒NVDC-JXA1-R（104.55.0TCID50/mL

13、）3mL，每天測溫并觀察21日。豬均應(yīng)發(fā)病，且至少2頭死亡。1.3.3 毒種代次 56代。2.2.6 毒種保存 在-70以下，保存期暫定為12個月。3 細胞系病毒培養(yǎng)用細胞為Marc-145，由中國動物疫病預(yù)防控制中心鑒定、保管和供應(yīng)。3.1 細胞標準3.1.1 細胞形態(tài) 用含8犢牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，37、5CO2培養(yǎng)2h即可貼壁，24h內(nèi)可長成單層。顯微鏡下，細胞呈三角形、多角形、圓形等多種形態(tài)。3.1.2 外源病毒檢驗3.1.2.1致細胞病變病毒檢驗 取2個細胞單層，每個單層至少6cm2，培養(yǎng)7天，每日觀察細胞，應(yīng)無細胞病變。3.1.2.2血吸附病毒檢驗 按現(xiàn)行中國獸藥典進行檢驗，

14、應(yīng)無紅細胞吸附現(xiàn)象。3.1.2.3 其它特定病毒的檢驗 采用PCR或RT-PCR方法檢測，應(yīng)無BVDV、PCV、CSFV、PPV、PRV和JEV污染。3.1.3胞核學(xué)檢查 對不同傳代水平的細胞，取50個處于有絲分裂中期的細胞進行檢查。在基礎(chǔ)細胞庫細胞中存在的染色體標志，在最高代次細胞中也應(yīng)存在。與基礎(chǔ)細胞庫的細胞相比，所有細胞的染色體模式數(shù)不得高出15%。核型必須相同。3.1.4致瘤性檢驗 用無胸腺小鼠至少10只，各皮下或肌肉注射107個待檢細胞，同時用Hela細胞皮下或肌肉注射無胸腺小鼠，每只106個細胞，作為陽性對照，用雞胚成纖維細胞作為陰性對照。觀察21日，Marc-145細胞應(yīng)無腫瘤形

15、成，陽性對照組應(yīng)出現(xiàn)明顯的腫瘤，陰性對照組應(yīng)為陰性。3.1.5 無菌檢驗 按現(xiàn)行中國獸藥典進行檢驗，應(yīng)無菌生長。3.1.6支原體檢驗 按現(xiàn)行中國獸藥典進行檢驗，應(yīng)無支原體生長。3.2 細胞代次 基礎(chǔ)細胞應(yīng)為110代，工作細胞代次應(yīng)為1025代，生產(chǎn)用細胞應(yīng)在40代以內(nèi)。3.3 保存 液氮保存。保存期36個月。4 疫苗制造及半成品檢驗4.1 生產(chǎn)用毒種制備4.1.1 毒種繁殖 將已長成單層的Marc-145細胞倒去生長液，換以含2毒種的細胞維持液，置37下培養(yǎng)23天，當(dāng)70以上細胞出現(xiàn)病變時收獲，置-40凍融1次，離心后分裝，然后進行鑒定。4.1.2 毒種鑒定 按1.2.1、1.2.2、1.2.

16、5項進行，應(yīng)符合規(guī)定。符合上述標準的毒種作為生產(chǎn)用毒種。4.1.3 毒種保存 在-70下保存，應(yīng)不超過12個月。4.1.4 毒種繼代 應(yīng)不超過3代。4.2 清場和記錄4.2.1 工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場，對工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進行處理。4.2.2 全面填寫生產(chǎn)記錄。5 半成品的制備5.1 條件準備5.1.1 根據(jù)毒液繁殖所需物料及設(shè)備條件，進行全面準備。5.1.2 按使用時間，將準備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。5.1.3 在工作開始前3040min，按凈化級別要求調(diào)整送風(fēng)量，達到潔凈級別要求。5.2 操作規(guī)則5.2.1 接種 取所需數(shù)量的、細胞覆蓋率達到

17、80%以上的細胞轉(zhuǎn)瓶，棄去生長液，按2（V/V）接種病毒，加入含2%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液，37C旋轉(zhuǎn)（912轉(zhuǎn)/小時）培養(yǎng)。5.2.2 收獲 在顯微鏡下觀察由病毒引起的細胞病變（CPE），直至CPE達到70%以上收獲細胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融1次，經(jīng)離心或過濾除去細胞碎片，凍存于-40C以下。5.3 半成品檢驗5.3.1 病毒含量 取病毒液按1.2.1項進行檢驗，病毒含量應(yīng)107.0TCID50/mL。5.3.2 無菌檢驗 按現(xiàn)行中國獸藥典進行檢驗，應(yīng)無菌生長。5.4 清場和記錄5.4.1 工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場，對工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進行處理。5.4.2 全面填寫

18、生產(chǎn)記錄。6 配苗6.1 條件準備6.1.1 根據(jù)配苗所需物料及設(shè)備條件，進行全面準備。6.1.2 按使用時間，將準備好的各種物品提前移入潔凈工作間待用。6.1.3 在工作開始前3040min，按凈化級別要求調(diào)整送風(fēng)量，達到潔凈級別要求。6.1.4 將檢驗合格的半成品于配苗前取出，融化待用。6.2 操作規(guī)則6.2.1 配制 將經(jīng)檢驗合格的病毒液按比例添加蔗糖脫脂乳凍干保護劑，充分混合均勻。6.3 清場和記錄6.3.1 工作結(jié)束后，應(yīng)全面清場，對工作間、所用器具、玻璃器皿、物料及廢棄物等應(yīng)按規(guī)定分別進行處理。6.3.2 全面填寫生產(chǎn)記錄。7 疫苗的分裝 操作內(nèi)容見分裝崗位標準操作規(guī)程。8 疫苗的

19、凍干 操作內(nèi)容見凍干標準操作規(guī)程。7 軋蓋、貼標 操作內(nèi)容見軋蓋標準操作規(guī)程、貼標標準操作規(guī)程。8 包裝 操作內(nèi)容見包裝標準操作規(guī)程III 成品檢驗見偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及檢驗試行規(guī)程、工藝衛(wèi)生與人員衛(wèi)生1 定期對潔凈室進行消毒，并根據(jù)沉降菌測定結(jié)果決定消毒周期。2 操作間的衛(wèi)生按各自區(qū)域的清潔消毒規(guī)程進行。3 生產(chǎn)設(shè)備按各自清潔規(guī)程進行清潔消毒。4 原輔料進入生產(chǎn)區(qū)按規(guī)定程序進行清潔消毒。5 人員進入潔凈區(qū)時，必須按規(guī)定進行人凈。進入潔凈區(qū)程序：更鞋脫外衣穿普通工作服更鞋脫普通工作服洗手穿潔凈服手消毒進入十萬級潔凈區(qū)更鞋手消毒套潔凈服手消毒進入萬級潔凈區(qū)。6 人員在生產(chǎn)區(qū)內(nèi)按區(qū)域個人衛(wèi)生要求進行管理。7 一般區(qū)工作服每三天清洗一次，十萬級區(qū)工作服每天清洗一次，萬級區(qū)工作服每班清洗一次，萬級潔凈區(qū)使用的工作服在清洗后進行滅菌，活毒操作區(qū)的工作服須經(jīng)滅菌后才能進行清洗。8 潔凈室溫度控制在1826，相對濕度控制在30-65%。潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)的靜壓差應(yīng)10帕。不同級別的相鄰潔凈區(qū)間壓差應(yīng)5帕。9 每批生產(chǎn)完畢，