Westernblot試劑配制及操作流程

1、Western-Blot操作流程試劑配制蛋白提取試劑1. RIPA裂解液:10mM Tris (,)1%NP40%Trit on X-100% 兌氧膽酸鈉2 mM EDTA1 mM PMSF20%甘 油調(diào)pH值至。cooktail ?；靹蚝? C保存，長(zhǎng)期保存于-20 C。使用時(shí)，加入蛋白酶抑制劑工作液制膠用（1-6）:1. L Tris HCI （）Tris 12.114g蒸餾水100ml溶解后，（用濃鹽酸調(diào)pH至），室溫下保存。2. L Tris HCI （）Tris 18.671g蒸餾水100ml溶解后，（用濃鹽酸調(diào)pH至），室溫下保存。3. 10 % SDSSDS 10g蒸餾水至 10

2、0ml如溶解困難，可在50C水浴下溶解，室溫保存 如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用4. 10 %過(guò)硫酸胺（AF）過(guò)硫酸胺蒸餾水 1ml（現(xiàn)用現(xiàn)配，可先將過(guò)硫酸胺干粉稱(chēng)好分量后放在管中，一次性多裝幾管，使用時(shí)加 入蒸餾水水即可，溶解后，4C保存，保存時(shí)間為1周）5. 四甲基乙二胺原液（TEME）4?C保存。6. 30初稀酰胺:4?C保存。10%F層膠，即分離膠（兩塊膠，15ml):膠的濃度根據(jù)自己所做蛋白的大小確定依次加入去離子水30%烯酰胺5ml1.5M Tris-HCI()10%SDS150口 I10%AP150口 ITEMED6口 I每加一種成分隨即搖勻，為了加快凝膠，可以將過(guò)

3、硫酸胺和TEME量加大，根據(jù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)時(shí)的溫度適當(dāng)調(diào)整，加入 TEME混勻后應(yīng)即刻灌膠。灌膠后加異丙醇（1ml）消泡 5%上層膠（兩塊膠，6ml）:依次加入去離子水30%丙烯酰胺1ml1M Tris-HCl ()10%SDS60口 l10%AP60口 lTEMED6口 l每加一種成分隨即搖勻，為了加快凝膠，可以將過(guò)硫酸胺和TEME量加大，根據(jù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)時(shí)的溫度適當(dāng)調(diào)整，加入TEME混勻后應(yīng)即刻灌膠。7. 5X電泳液緩沖液Tris ()15.1g甘氨酸（）94gSDS5.00g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存，用時(shí)稀釋5倍，通常取160ml配制成800ml即可。& 10X轉(zhuǎn)膜緩沖液甘氨酸（）Tris

4、（）30.3g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存，用時(shí)稀釋10倍，并加入甲醇至20%（先加甲醇易通常取80ml母液，加560ml蒸餾水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可 產(chǎn)生沉淀）9. 10XTB緩沖液Tris （）24.2gNaCI80.0g蒸餾水至1000ml（濃鹽酸調(diào)pH至），溶解后室溫保存10. 1XTBS緩沖液10XTB緩沖液100ml蒸餾水 900mlTwee n-201 ml因Twee n-2 0比較粘稠，應(yīng)緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊，即可防止產(chǎn)生氣泡 溶解后室溫保存。11 .封閉液/抗體稀釋液（5%兌脂牛奶）:1XTBST 緩沖液 95-100 ml脫脂奶粉 5g溶解后

5、4C保存，可于一周內(nèi)使用步驟：SDS- PAG電泳（ 1） 清洗玻璃板：兩面都擦洗過(guò)后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。（ 2） 灌膠與上樣1、玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。2、按前面方法配12%下層膠（15ml，兩塊膠，每塊膠在7ml左右），加入TEME后立即搖勻即可 灌膠。 灌膠后膠上加一層異丙醇醇（1ml左右），液封后的膠凝的更快。3、當(dāng)水和膠之間有一條折射線(xiàn)時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。棄去異丙醇，用水沖洗，并用吸水紙將水吸干。4、 等待膠凝期間可計(jì)算含10-100ug蛋白的溶液體積即為上樣量 （根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn) 需要進(jìn)行選擇, 沒(méi)有固定的量）取出上樣樣品至EP管

6、中，加入5X上樣緩沖液至終濃度均為IX。上樣前要將樣品于沸水中煮5-10min使蛋白變性。5、 按前面方法配5%的上層膠（6ml，兩塊膠），加入TEME后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌 滿(mǎn)濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中（從梳子的一頭開(kāi)始插）。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。 插梳子時(shí)要使梳子保持水平。 由于膠凝固時(shí) 體積會(huì)收縮減小（也提示膠已經(jīng)凝固），從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在上層膠凝固的過(guò)等待上層膠凝固期間配制1X電泳緩沖液。6、 加入1X電泳緩沖液，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。*電泳緩沖液一定要 加至超過(guò)玻璃板的上緣（量要足夠多），否則電泳期間會(huì)出現(xiàn)電流

7、過(guò)低的現(xiàn)象，進(jìn)而影響電泳 的效果。7、上樣Marker 7 口 I樣本根據(jù)自己的樣品決定實(shí)驗(yàn)所用 Thermo 26619# Marker電泳后出現(xiàn) 9條帶：10, 15, 25, 35, 55, 70, 100, 130, 250KDa（具體條帶數(shù)目會(huì)因?yàn)槟z的濃度不同而不同），最少4條帶（6%的分離膠時(shí)出現(xiàn) 70， 100， 130，250KDa）。（3）電泳：幵始恒壓，電壓80V,電泳跑到分離膠以后可調(diào)節(jié)電壓到120V電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（一般要讓目的條帶跑過(guò)分離膠的1/3比較好）。電泳結(jié)束前20分鐘配制1X轉(zhuǎn)膜緩沖液。（四）轉(zhuǎn)膜1 ） 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 4張濾紙和 1

8、張硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套 （因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜）。將切好的硝酸纖維素膜現(xiàn)在甲醇中浸 泡激活，后和濾紙置于1X轉(zhuǎn)模緩沖液浸濕。（2） 夾子黑的一面：海綿-2張濾紙-膠-PVDF莫-2張濾紙-海綿（順序一定注意）將夾子打幵使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。在墊子上墊二層濾紙，先將玻璃板撬幵，隨后將濃縮膠輕輕刮去， 小心剝下下層膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊， 輕輕用玻棒搟去氣泡。將硝酸纖維素膜蓋于膠上， 要蓋滿(mǎn)整個(gè)膠并 除 氣泡。在膜上蓋2張濾紙并除去氣泡（膜蓋下后不可再移動(dòng)）。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下 就可合起夾子。要不斷的搟

9、去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。如果同時(shí)做兩塊膠，轉(zhuǎn)膜的時(shí)候應(yīng)記住樣本的位置。（3）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使 夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn) 熱，故放冰來(lái)降溫。一般用恒流400mA專(zhuān)膜。實(shí)際上應(yīng)該根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間，如果同時(shí)做兩塊膠，轉(zhuǎn)膜結(jié)束應(yīng)在膜上做標(biāo)記，以便查詢(xún)相應(yīng)樣本。轉(zhuǎn)膜后，膜要分正反面，轉(zhuǎn)膜時(shí)靠膠的一面為正面。轉(zhuǎn)膜結(jié)束前配制封閉液（5%兌脂牛奶）及1X TBST緩沖液。如果做磷酸化抗體等，需要用血清封 閉，具體情況可參考抗體說(shuō)明書(shū)。1-2h（五）免疫反應(yīng)（1）封閉：將膜用移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉(2)

10、抗將一抗用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度；加入抗體， 4度過(guò)夜， 次日用1X TBST在室溫下脫色搖 床上洗三次，每次5min。（3）二抗同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液，室溫下孵育1-2h后，用1X TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。（六）化學(xué)發(fā)光，顯影，定影（1）將A和B兩種試劑等量等體積混合；打幵X-光片夾，鋪上保鮮膜，將膜正面朝上放于保鮮膜上，滴加此混合液1-3min后（見(jiàn)到熒光）（2）將1 X顯影液，自來(lái)水和定影液分別到入盤(pán)中；在紅燈下取出X光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大1cm）;把乂一光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上 X-光片夾，幵始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光 時(shí)間，一般為1mi n到5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打幵X-光