蔗糖酶的分離提純及酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗

1、13.02.2021,1,蔗糖酶的分離提純及酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗,13.02.2021,2,內(nèi)容提示,本實驗含如下內(nèi)容（1、2、3是酶分離提純及比活力測定部分的內(nèi)容；4、5是酶促反應(yīng)動力學(xué)部分的內(nèi)容）： 1、 3，5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法）工作曲線的制 作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2 、E3）的測定（酶活力）； 2、 Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作及三種蔗 糖酶樣品（E1、E2 、E3）的測定（蛋白質(zhì)含量）； 3、蔗糖酶的分離提純（細胞破壁、抽提、有機溶劑分級、 透析和離子交換柱層析裝柱、上樣、洗柱、洗脫、收 集酶活力峰、保存）； 4、蔗糖酶米氏常數(shù)的測定（用雙倒數(shù)法）

2、； 5、用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響（含實驗設(shè) 計及數(shù)據(jù)處理的相關(guān)知識,13.02.2021,3,一、目的要求,1.熟悉工作曲線的制作方法及使用注意事項； 2.學(xué)習掌握3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理和方法； 3.學(xué)習掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法； 4.學(xué)習酶蛋白分離提純的原理； 5.學(xué)習掌握細胞破壁、抽提、有機溶劑分級、透析和離子交換柱 層析技術(shù)； 6.學(xué)習掌握酶的比活力測定及其計算方法； 7.學(xué)習掌握酶促反應(yīng)動力學(xué)中用雙倒數(shù)法測定Km的方法、選擇確 定酶促反應(yīng)最適條件（溫度、pH值、離子濃度等）的方法； 8.學(xué)習正交試驗法中最簡單的入門知識：用正交表設(shè)計 試驗

3、方案、用極差分析處理試驗數(shù)據(jù)并分析試驗結(jié)果,13.02.2021,4,二、實驗原理,前 言 酶是生物體內(nèi)具有催化功能的蛋白質(zhì)，可據(jù)酶蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇分離提純條件和含量測定方法。 酶分離提純的總目標是提高純度（或比活力）及收率；依據(jù)在溶液中的性質(zhì)（分子大小、溶解度、電荷、吸附等）進行分離; 胞內(nèi)酶的分離提純步驟：選材、破壁、提取、分 離、純化、測活、保存；用測定酶活力的方法跟蹤酶的去向、 衡量酶提純的程度和得率。 酶促反應(yīng)的動力學(xué)（反應(yīng)速度及影響因素）: 1）底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響 2）酶濃度對酶促反應(yīng)速度的影響 3）pH值對酶促反應(yīng)速度的影響 4）溫度對酶促反應(yīng)速度的影響 5）激活劑

4、、抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響,13.02.2021,5,13.02.2021,6,13.02.2021,7,13.02.2021,8,4、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理： 1）凡含有兩個及兩個以上肽鍵（CONH）的化合物（如雙縮脲：H2NCONHCONH2），在堿性溶液中（如Folin-甲試劑）都能與Cu2+作用，形成紫色的復(fù)合物； 2）蛋白質(zhì)是由多個氨基酸通過肽鍵連接起來的，故所有的蛋白質(zhì)均可與Folin-甲試劑反應(yīng)，形成紫色的銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物； 3）銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物在pH=10的堿性溶液中可將磷鉬酸-磷鎢酸（Folin-乙試劑）還原成蘭色的鉬藍和鎢藍混合物，其顏色的深淺（在一定范圍內(nèi)

5、）與蛋白質(zhì)的含量成正比； 在測定液體蛋白質(zhì)樣品含量的常用方法中（雙縮脲法、 Folin-酚法和紫外吸收法），F(xiàn)olin-酚法的靈敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比雙縮脲法高100倍），所以我們選用本方法,13.02.2021,9,5、有機溶劑分級沉淀的原理： 有機溶劑分級是利用不同Pr在不同濃度的有機溶劑中溶解度的差異分離酶蛋白的一種方法。 其原理是： 1）有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加Pr分子上不同 電荷的引力，使蛋白質(zhì)的溶解度下降； 2）有機溶劑與水作用，能破壞Pr的水化膜，使蛋白質(zhì)的 溶解度下降。 6、離子交換柱層析的原理： 是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的

6、技術(shù)。在分離過程中，以離子交換作用為主導(dǎo)；在眾多的交換劑中，離子交換纖維素的優(yōu)點是,13.02.2021,10,1）有開放性的長鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對Pr 的吸附容量大； 2）纖維素上離子基團的數(shù)量不多且排列疏散，對 Pr的吸附不是太牢固，所以用緩和的洗脫條件即 可達到分離的目的，不致引起Pr的變性； 3）用其裝好的層析柱在較廣的pH和鹽濃度范圍內(nèi)都 不會發(fā)生體積的改變，所以有利于Pr的層析。 本實驗中使用的DEAE-c11是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團為二乙基氨乙基。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,13.02.2021,11,三、實驗流程,周三晚上6：

7、00開始 周四下午1：00開始 1、制備蔗糖酶粗品E1 2、制作DNS比色定糖的工作曲線 （當天畫出工作曲線） 自溶 3、制作Folin-酚法測定蛋白質(zhì) 含量的工作曲線 （當天畫出工作曲線） 抽提 （過夜,13.02.2021,12,4、乙醇分級和透析（制E2） 離心得E1（無細胞抽提液） 取樣、測定酶E1活力及蛋白質(zhì)濃度 第一次乙醇分級（32%乙醇飽和度） 第二次乙醇分級（47.5%乙醇飽和度） 透析（過夜,13.02.2021,13,5、柱層析的準備工作 組裝層析裝置,裝柱、柱平衡（過夜,13.02.2021,14,6、 柱層析（制E3） 周五下1：00開始 離心（得E2 ） 取樣、 測酶

8、E2活力及蛋白質(zhì)濃度 上樣 洗柱（用目測酶活力的方法檢測目的酶是否掛上） 洗脫 合并酶活力峰,得E3 保存成品E3 測酶E3活力及蛋白質(zhì)濃度,13.02.2021,15,成品E3 計算出E3濃度 周六（全天）上午8：00開始 (1).蔗糖酶米氏常數(shù)的測定 (2).用正交法測定幾種因素 對蔗糖酶 活力的影響,13.02.2021,16,四、操作步驟及注意事項,1、 DNS比色定糖法工作曲線的制作 取11支血糖管編號111，按下頁表中的順序和數(shù)量加入葡萄糖標準溶液（0.2%）、蒸餾水、3，5-二硝基水楊酸試劑，混勻后同時放入沸水浴中準確反應(yīng)5分鐘（注意：一定等沸水浴鍋中的水沸騰后再放入試管，且不要

9、用大玻璃杯代替沸水浴鍋；用秒表記時），取出后立即用流動的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測定540nm處的A值。 以葡萄糖(mg)含量為橫坐標、A540值為縱坐標，畫出工作曲線,13.02.2021,17,3，5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作,試號 含糖量 葡萄糖標準液 去離子水 3，5-二硝基水楊酸試劑 A540 （mg） （ml） （ml） （ ml） 1 0 0 2.0 3 2 0.4 0.2 1.8 3 3 0.8 0.4 1.6 3 4 1.2 0.6 1.4 3 5 1.6 0.8 1.2 3 6 2.0 1.0 1.0 3 7 2.4 1.2 0.8 3 8 2.

10、8 1.4 0.6 3 9 3.2 1.6 0.4 3 10 3.6 1.8 0.2 3 11 4.0 2.0 0 3,13.02.2021,18,2、Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作 取7支試管（干燥）按下表中順序加入各種試劑并進行反應(yīng)和測定 以1號管為參比調(diào)零，記錄光密度值A(chǔ)650，以標準液的濃度為橫坐 標， A650值為縱坐標，畫出工作曲線,13.02.2021,19,Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的方法,1.樣品的測定：取兩支試管（平行）各加入樣品液（稀 釋成一定濃度的）1ml ，其他操作（反應(yīng)和比色測 定）同工作曲線的制作（前頁） 2.蛋白質(zhì)濃度的計算： A650值對應(yīng)的

11、g數(shù)(Pr)10-3 Pr (mg/ml)= 稀釋倍數(shù) Pr溶液的ml數(shù),13.02.2021,20,制作工作曲線的注意事項 1.分光光度計的使用： 1）測樣時,光吸收值A(chǔ)應(yīng)在0.1000.700之間，并小于標準曲 線的最大值，否則，縮小or加大樣品的稀釋倍數(shù)，重測！ 2）其他，見（523室）操作規(guī)程； 2.比色杯的使用： 1).洗凈（洗凈的標準是：透明、無痕跡、不掛水珠）后，置 小燒杯內(nèi)用蒸餾水浸沒； 2).用蒸餾水or buffer校正（方法在儀器室講），然后在杯 底標上記號（0、1、2、3）； 3).向杯中加樣液時，按濃度從低到高的順序加，注意加樣到 比色杯的2/3處； 4).如樣液有外

12、溢，先用濾紙條吸干（不許檫）；再用鏡頭紙 向一個方向檫至透明； 5).將裝有參比、樣品溶液的比色杯放入比色杯架上時，要擺 放在一條直線上,13.02.2021,21,6).倒出液體后，一定要用洗瓶中的蒸餾水洗凈，然后倒置在濾紙 上吸干； 7).任何情況下都不許把比色杯放在儀器蓋上； 8).自備廢液杯（盛廢液及廢紙塊用）； 9).各臺分光光度計的比色杯是配套的，不許隨意調(diào)換使用。 3.工作曲線的制作（以Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的工作曲線為例） 1）反應(yīng)： 取液量準確：移液管洗凈、標號、潤洗，最好同一人取樣； 溫度準確：（恒溫水浴中放有溫度計），記時準確（用秒表）； 所用的標準液、buffe

13、r、反應(yīng)液應(yīng)是同一批配制的； 加入Folin-乙試劑時要特別小心！因為Folin-乙試劑只有在酸 性條件下穩(wěn)定，而反應(yīng)是在堿性溶液中進行，所以加入Folin- 乙試劑后，一定要迅速搖勻（加一管搖一管,13.02.2021,22,2）測量： 由同一個人讀數(shù)； 制作標準曲線及測量樣品使用同一臺儀器； 3）記錄： 實驗記錄本記錄要清晰（不許用紙片），實驗結(jié)束后要 請教師簽字； 記錄儀器使用情況。 4）制圖： 標明：曲線名稱、縱橫坐標的單位、儀器號、使用時間； 注意實驗點的分布、大?。ㄒ罁?jù)誤差）、直線的角度 （最好在45度左右）； 不許延長工作曲線（比耳定律適用于稀溶液中的反應(yīng)）。 附：標準液的配制：

14、 濃度必須準確，要注意烘干、稱量、定容等操作； 分裝or取液時防止被稀釋,13.02.2021,23,3、 蔗糖酶粗品（E1）的制備 自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml燒杯中、少量多次地 加入50ml蒸餾水，攪拌均勻，成糊狀后加入1.5g乙酸鈉、25ml乙酸乙 酯，攪勻，再于35 恒溫水浴中攪拌30分鐘，觀察菌體自溶現(xiàn)象； 抽提：補加蒸餾水30ml，攪勻，蓋好，于35 恒溫過夜，8000r/min 離心10min，棄沉淀及脂層，得E1（無細胞提取液）； 量體積V1=（ ）ml（取出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測酶活力 及蛋白質(zhì)濃度）。 4、乙醇分級和透析（制E2） 測E1p

15、H、用稀HAC調(diào)pH至4.5（注意少量、慢加、攪勻，防止調(diào)過）； 第一次乙醇分級（32%乙醇飽和度）： 計算出使E1的乙醇濃度達32%時，所需95%乙醇的體積X1，將E1和乙醇X1，放入冰鹽浴中預(yù)冷，在不斷攪拌下，緩慢滴加乙醇，3000r/min，離心5min，棄沉淀，留上清,13.02.2021,24,第二次乙醇分級（47.5%乙醇飽和度）： 同上法加入X2（為達47.5%乙醇飽和度時需要補加的95%乙醇的體積），離心3min，棄上清，沉淀立刻用10ml 0.005mol/L pH6.0的磷酸buffer溶解，并裝入透析帶（截止分子量一萬的），對上述buffer透析過夜；次日，3000r/m

16、in離心3min，得E2，量體積V2=（ ）ml（留出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測酶活力及蛋白質(zhì)濃度），其他酶液準備上樣。 5. 柱層析（制E3） 裝柱：本實驗使用的層析柱是自加工的，用泡沫海綿為篩板。裝入纖維素前，先把柱內(nèi)裝滿起始緩沖液，用玻璃棒擠壓海綿,趕盡氣泡并把柱子垂直固定；將纖維素用起始緩沖液調(diào)稀、攪允后加入，柱內(nèi)的纖維素應(yīng)非常均勻地分布，防止出現(xiàn)節(jié)面和氣泡，床面要平整，床高距柱頂23cm為宜；用起始緩沖液洗柱,控制好流速（防止流干），于4平衡過夜,13.02.2021,25,上樣：次日，將柱中的緩沖液逐漸放出，當頂部液面達到近于柱床表面時，開始用細長的玻管沿柱壁繞環(huán)加入酶樣E

17、2，待樣液達2cm后再在柱中間小心加樣，注意控制流速，使流出液的流出速度為1ml/min左右。 洗柱：樣品全部進入床面后，用5倍柱體積的起始緩沖液流過層析柱，洗出未吸附的物質(zhì)，此時應(yīng)目測酶活力，檢查流出液中是否有酶活力存在（即目的酶是否掛在纖維素上）。 洗脫：因梯度洗脫裝置不齊，本實驗用階段洗脫進行。 用含0.15mol/LNaCl的 0.005mol/L pH6.0的磷酸緩沖液100ml，控制流速為1ml/min ,用小試管收集，3ml/每管。 收集酶活力峰：每隔一管目測酶活力，確定酶活力峰的位置，合并酶活力峰,得進一步提純的E3，量出E3的體積V3=（ ）ml（留出2ml置于冷處或冰鹽浴中

18、保存，待測酶活力及蛋白質(zhì)濃度），其它酶液封好、記名，于4保存，留反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)實驗使用,13.02.2021,26,6、蔗糖酶活力及蛋白質(zhì)含量的測定,一）、蔗糖酶活力的測定： 1. 蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實驗條件下，每3分鐘釋放1毫克還原糖所需 的酶量定義為一個活力單位。 2操作：取兩支試管分別加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸緩沖液適當稀釋 過的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，搖勻，使酶失活（做 對照），另一支做測定管；把兩支試管和5%的蔗糖溶液放入35水浴 中預(yù)熱恒溫；分別取2ml 5%的蔗糖加入上述兩試管中，并準確計算時 間，3分鐘后于測定管中加入 0.5

19、ml 1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng) 3 .從反應(yīng)混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3,5 二硝基 水揚酸試劑和1.5ml水，搖勻。于沸水浴中準確反應(yīng)5min，立即用冷水 冷卻，加水稀釋至25ml，搖勻，于540nm處測光密度。 4. 在葡萄糖標準曲線上找到所測定光密度值對應(yīng)的葡萄糖含量，按下面 公式計算酶活力： 蔗糖酶活力單位=葡萄糖毫克數(shù)9酶的稀釋倍數(shù),13.02.2021,27,二）、目測酶活力的方法： 1. 洗柱時用的目測酶活力方法：取兩支試管，各加入1ml 5%蔗糖液，然后于一支中加入1ml起始緩沖液，另一支中加1ml洗柱流出液，同時于35恒溫水浴中進行水解

20、反應(yīng)3min，然后各加DNS 試劑1ml ，于沸水浴中反應(yīng)5min ，比較兩支試管顏色的深淺； 2. 收集酶活力峰時用的目測酶活力方法：于收集管（每隔一管）中取0.1mlE液+1ml 5%蔗糖液，于35水解反應(yīng)3min后，加0.2ml 1mol/L NaOH終止反應(yīng)，然后加DNS 試劑1ml ，于沸水浴中準確反應(yīng)5min ，比較各管顏色的深淺，再加密實驗點，重復(fù)測定，確定酶活力峰的位置。 （三）、三種蔗糖酶（E1、E2 、E3）蛋白質(zhì)濃度的測定： 用 Folin-酚法 測定,13.02.2021,28,五、結(jié)果及數(shù)據(jù)處理,1.洗脫曲線 蛋 白 酶 質(zhì) 活 含 力 量 管號 2.原始數(shù)據(jù),13.

21、02.2021,29,3.數(shù)據(jù)處理 有關(guān)計算 1）E=葡萄糖mg數(shù)（4.5/0.5）E的的稀釋倍數(shù)/2ml =（ ）u/ml 2）總活力：EV 3）Pr：查標準曲線 4）總Pr量：PrV 5）比活力：E/Pr or 總活力/總Pr量 6）階段收率：E2活力/E1活力、E3活力/E2活力 7）總收率：E3總活力/E1總活力 8）提純倍數(shù)：比活力n/比活力n-1 n=1，2，3 將計算出的數(shù)據(jù)添入下表中,13.02.2021,30,4.實驗結(jié)果表,蔗糖酶酶樣品,E E E,酶濃度,總活力,蛋白濃度,總蛋白量,比活力,提純倍數(shù),階段收率,總收率,ml）（u/ml）（u）（mg/ml） （mg） （u

22、/mg） （%） （,樣品體積,13.02.2021,31,六、主要參考資料,1、李建武 主編 .生物化學(xué)實驗原理和方法 . 北京大學(xué)出版社 .1994 該書中的：p36-46 （離子交換層析法） 2、沈同 王鏡巖主編 .生物化學(xué) 第二版 上冊 高等教育出版社 .1993 該書中的：p 209、 210、215、216、220中有關(guān)論述 3、張樹政 主編 .酶制劑工業(yè) 上冊 .科學(xué)出版 社 .1998,13.02.2021,32,七、思考題,1） 指出有機溶劑分級沉淀法的原理及操作中 的注意事項。 2） 說明離子交換柱層析的原理及裝好層析柱 的具體要求。 3） 比較線性梯度洗脫與階段洗脫的區(qū)別

23、。 4） 分別指出判斷酶損失程度和酶提純方法優(yōu) 劣的標志,13.02.2021,33,其 它,1） 這個實驗較大，涉及到的理論知識和實驗技術(shù)都較多，用的時間也很長，要求同學(xué)們一定做好預(yù)習，寫好預(yù)習報告（方式不限，但一定要寫在本子上，并留出記錄實驗數(shù)據(jù)和實驗現(xiàn)象的位置），否則將嚴重影響實驗進度！ 2） 你們年級的理論課還沒講到酶學(xué)部分，預(yù)習時可以看實驗課教材（我在編寫時已經(jīng)進行了整理和補充）,但教材中有印刷錯誤,應(yīng)以該課件為準. 3） 本實驗從一開始，就要縱觀全局，在各個環(huán)節(jié)都要注意防止酶失活；只要時間允許，一定要用測定酶活力的方法跟蹤酶的去向； 4） 實驗制品E3要保留！酶促反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)實驗

24、用,13.02.2021,34,蔗糖酶米氏常數(shù)的測定,一、目的要求：了解底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的關(guān)系，學(xué)習蔗糖酶米 氏常 數(shù)的測定方法。 二、實驗原理：米氏常數(shù)Km等于酶反應(yīng)速度達最大反應(yīng)速度一半時的底 物濃度，單位是mol/L 。對于某一種特定的酶，在特定的反應(yīng)條件 下，對應(yīng)任何一種底物（如果它具有多個底物），它的米氏常數(shù) Km是一個定值。在一個反應(yīng)中，底物的濃度（S）是可以控制的，反 應(yīng)的速度（V）可以測出，這樣就可根據(jù)底物的濃度和反應(yīng)的速度求 出該酶在本實驗條件下的米氏常數(shù)。通?？梢酝ㄟ^以下幾種方法求 出Km值： 1）直接將數(shù)據(jù)代入米氏方程。 2）Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作

25、圖法（本實驗采用該法），橫軸的截距 為：-1/Km。 3）Hanes-Woolf作圖法，橫軸的截距為：-Km。 4）Woolf-Anguseinsson-Hoftee作圖法，斜率為：-Km。 5）Eadie-Scatchard作圖法，斜率為-1/Km,13.02.2021,35,三、操作方法： 1.取試管8支，按0、1-7編號，0為空白。 2.按表1將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于35 水浴中保溫（使溫度平衡，以下同）10min。 3.取約20ml酶液，放入同一水浴中保溫約10min。 4.于各管中依次按同樣時間間隔加入已保溫過的酶液2ml， 記時，立即搖勻。在35水浴中準確反應(yīng)3min

26、。 5.按同樣次序和時間間隔，加入0.5ml的1mol/L NaOH，搖勻 ，終止反應(yīng)。 6.吸取反應(yīng)混合物0.5ml，加入盛有1.5ml DNS試劑和1.5ml 去離子水的血糖管中，放入沸水中加熱5min，冷卻后稀釋 定容至25ml，搖勻后，測定A540值,13.02.2021,36,表1 Km值的測定,13.02.2021,37,四 數(shù)據(jù)處理： 以A值作為相對反應(yīng)速度，以1/S為橫坐標， 1/A為縱坐標作圖，由圖求出Km值。 五、思考題： 1.說明米氏常數(shù)的物理意義及單位？ 2.用雙倒數(shù)法測定Km值時，應(yīng)注意的主要問題是什么,13.02.2021,38,用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影

27、響,一、目的要求 1.初步掌握正交實驗設(shè)計方法的使用； 2.求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值。 二、實驗原理 1. 酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如：底物濃度、酶濃度、溶液的pH值和離子濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響催化反應(yīng)的速度。通常是在其他因素恒定的條件下，通過對某因素在一系列變化條件下的酶活性測定，求得該因素對酶活力的影響，這是單因素的簡單比較法。本實驗使用正交實驗設(shè)計法測定溫度、pH值、和離子濃度三種因素對蔗糖酶活性的影響，這是多因素（3）的實驗方法,13.02.2021,39,正交法是通過正交表安排多因素實驗，利用統(tǒng)計數(shù)學(xué)原理進行數(shù)據(jù)分析的一種科學(xué)方法，

28、它符合“以盡量少的試驗，獲得足夠的、有效的信息”的實驗設(shè)計原則。 2. 本實驗以自制的蔗糖酶（E3）為測定對象。蔗糖酶是一種水解酶，可使蔗糖水解為D-果糖和D-葡萄糖。 酶活性的測定，是利用DNS試劑與D-葡萄糖共熱后生成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，葡萄糖的量和反應(yīng)液的顏色呈比例關(guān)系，利用比色法可測得酶促反應(yīng)后生成的還原糖量,13.02.2021,40,三、操作方法,1.實驗設(shè)計： 1）確定指標：即實驗的結(jié)果。本實驗的指標是酶活力。這里，用A540值表示，能落在葡萄糖工作曲線范圍內(nèi)的A540值越高，指標越好。 2）制定因素水平表：考察三個因素（溫度、pH值和離子濃度），每個因素取三個水平

29、。水平是因素變化的范圍（通常是根據(jù)專業(yè)知識確定。如無資料可借鑒，應(yīng)先加寬范圍再逐步縮?。﹥?nèi)要進行實驗的具體條件，如表1,13.02.2021,41,表1 因素水平表,13.02.2021,42,3）選擇正交表：可容納三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（366）和L27（389）。本實驗不考察各因素間的交互作用，也沒設(shè)計混合水平，只有水平數(shù)均為3的的三個因素，故選用L9（34）表，見表2。 按一般的實驗方法： 簡單比較法（最常用），因?qū)嶒烖c分配不均衡，易把好條件漏掉，又因數(shù)據(jù)無規(guī)律而對結(jié)果無法進行分析和判斷。 全面實驗法：（即對三個因素三個水平的各種搭配都考察）要進行3

30、3=27次實驗。而用正交表L9（34），只做九次實驗，就可以找到好的實驗條件,13.02.2021,43,而且，還可以進行如下分析： A. 判斷各因素的水平范圍是否選偏； B. 判斷各因素顯著性大小的順序； C. 判斷實驗結(jié)果的置信度。 由表2可見，正交表L9（34）有任何正交表都具有的如下特點： A .任何一列各水平出現(xiàn)的次數(shù)相等，該表均為3次,13.02.2021,44,表2 正交表L9（34,13.02.2021,45,B. 任何兩列橫行組成的數(shù)字對出現(xiàn)的次數(shù)都相等。該表有9個數(shù)字對，即（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，

31、3）都出現(xiàn)一次。 C. 任何兩列同名數(shù)對出現(xiàn)的次數(shù)都相等。該表中有3個同名數(shù)對，即（1，1）、（2，2）、（3，3），均出現(xiàn)一次。 以上特點，保證了用正交表安排的實驗計劃是均衡搭配的，因此可以進行綜合比較和方差分析。 4）安排實驗：將本實驗的三個因素分別放在L9（34）表的第1、2、3列中，再將各列的水平數(shù)用該因素相應(yīng)的水平寫出來，即得到實驗安排表，見表4的上半部分,13.02.2021,46,2. 具體操作步驟,1）將已配制好的三種不同pH的0.2mol/L的緩沖液于 9支試管中按表3進一步稀釋至一定濃度。 表3 三種不同pH buffer的稀釋表,13.02.2021,47,2）另取18支

32、試管，編號19及1-9（平行組），按表4中2、3列的要求，分別加入上述不同pH不同濃度的緩沖液2ml及蔗糖酶液（濃度15U/ml左右）1ml，混勻。 3）按表4中第一列的要求，將19及1-9試管分別放入相應(yīng)溫度的恒溫水浴中保溫10min。 4）另取足量的0.2mol/L蔗糖液三份，分別置于20、35、50水浴中保溫5min。 5）向19及1-9試管中，依次間隔1min（或2min）加入相同溫度下保溫過的0.2mol/L蔗糖液1ml，立即記時，搖勻，放回原來溫度的水浴中，準確反應(yīng)3min。 6）按上述次序和時間間隔，加入1mol/L NaOH液0.5ml，搖勻。 7）空白管：另取一支“0”號試管，加入15U/ml酶液1ml，1mol/LNaOH液0.5ml，搖勻，再加入0.2mol/L蔗糖液1ml及去離子水2ml。 8）分別于各管中吸取反應(yīng)物0.5ml，加入對應(yīng)編號的盛有3mlDNS試劑的血糖管中，放入沸水浴中加熱（要用銅水浴鍋，一定保持沸騰），準確反應(yīng)5min，急速水冷后，稀釋至25ml，搖勻。以空白