腸道微生物組的現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法綜述(2)

1、腸道微生物組的現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法綜述(2)2.3.2隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphic DNA,RAPD）技術(shù)利用寡核苷酸序列在基因組上隨機(jī)配對(duì)的特性，經(jīng)擴(kuò)增得到一系列大小不同的產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳便可得到一系列基于RAPD的指紋圖譜。因?yàn)椴煌０釪NA產(chǎn)生的指紋圖譜有差異，因此可用于鑒定微生物種類，并且靈敏度高，常被用于細(xì)分微生物組內(nèi)的種群差異11-12.RAPD技術(shù)的缺點(diǎn)在于重復(fù)性和穩(wěn)定性差，產(chǎn)生的圖譜條帶過于復(fù)雜，需要進(jìn)行大量的篩選，從中找到較為合適的引物進(jìn)行分析，較為費(fèi)時(shí)。2.3.3末端

2、限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)末端限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析（terminal restrictionfragment length polymorphisms,T-RFLP）技術(shù)通過自動(dòng)測(cè)序儀分析酶切后的末端序列，達(dá)到定量的目的，因?yàn)槟┒诵蛄衼?lái)自16SrDNA,因此可用于復(fù)雜的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，快速靈敏地評(píng)估群落中微生物的多樣性，并給出微生物群落結(jié)構(gòu)的指紋圖譜，是目前被廣泛采用的一種指紋圖譜技術(shù)，現(xiàn)已成功應(yīng)用于各種微生物群落結(jié)構(gòu)和多態(tài)性的比較分析13-14.其缺點(diǎn)在于該技術(shù)只檢測(cè)末端序列，因此不可避免地會(huì)低估微生物群落結(jié)構(gòu)多態(tài)性。同時(shí)它是基于PCR擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)驗(yàn)過程影響因素較多，亦會(huì)對(duì)結(jié)

3、果造成影響。2.4熒光原位雜交技術(shù)除了上述技術(shù)外，分子雜交技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于腸道微生物組的研究中，同樣表現(xiàn)出應(yīng)用潛力和優(yōu)點(diǎn)。Giovannoni等首次應(yīng)用熒光原位雜交（fluo-rescence in situ hybridization,FISH）技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)的研究。隨后Delong等使用熒光標(biāo)記寡核苷酸探針檢測(cè)單個(gè)微生物細(xì)胞。經(jīng)過不斷的豐富和完善，F(xiàn)ISH技術(shù)已成為近年腸道微生物研究中一種重要的檢測(cè)工具15-16.其利用熒光素標(biāo)記16SrRNA基因序列的寡聚核苷酸探針，與靶細(xì)菌雜交，通過檢測(cè)目標(biāo)序列來(lái)鑒定微生物，具有敏感、快速、安全等優(yōu)點(diǎn)。FISH技術(shù)還可用于鑒定和檢測(cè)未培養(yǎng)種屬和新種屬

4、。其缺點(diǎn)在于FISH技術(shù)尚不能用于16SrRNA序列未知微生物的檢測(cè)，且在操作時(shí)易受到污染干擾，同時(shí)結(jié)果會(huì)受到微生物營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的影響。由于腸道微生物組種類繁多，而聯(lián)合流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)可進(jìn)行高通量分析，已越來(lái)越多地應(yīng)用于FISH信號(hào)檢測(cè)。3新近發(fā)展的方法技術(shù)3.1基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)（DNA chips）原理是使探針分子在濾膜、硅片、玻璃等介質(zhì)上排列成微矩陣，將待檢樣品標(biāo)記后與微矩陣雜交，通過檢測(cè)樣品雜交信號(hào)強(qiáng)度即可獲得樣品中基因序列及數(shù)量等信息，具有快速、高效、低成本等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的研究17-19,并且其敏感性和特異性已經(jīng)得到了反復(fù)驗(yàn)證20-21.目前尚沒有應(yīng)用基因

5、芯片進(jìn)行人體腸道微生物研究的報(bào)道，但基因芯片包括大量針對(duì)人體腸道微生物的功能基因，并且其子類型HummChip是專門針對(duì)人體微生物設(shè)計(jì)的，因此基因芯片技術(shù)應(yīng)用于腸道微生物研究不存在技術(shù)問題。3.2宏基因組學(xué)技術(shù)宏基因組學(xué)即將環(huán)境中全體微生物的遺傳物質(zhì)看作一個(gè)整體，系統(tǒng)全面地研究微生物與其生存環(huán)境之間的關(guān)系。通過宏基因組測(cè)序技術(shù)可發(fā)現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)改變，結(jié)合其代謝特征可分析腸道微生物與代謝性疾病之間的聯(lián)系。宏基因組學(xué)還可用來(lái)發(fā)現(xiàn)新發(fā)傳染病病原以及未知病原。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health,NIH）的人類微生物組計(jì)劃22-23利用宏基因組學(xué)技術(shù)分析了24

6、2個(gè)美國(guó)健康志愿者微生物基因組，獲得了近800個(gè)菌種的基因參考序列。宏基因組學(xué)技術(shù)為腸道微生物組的研究提供了新的思路與方法，為充分認(rèn)識(shí)和利用未培養(yǎng)微生物、完整地從群落水平上認(rèn)識(shí)微生物開辟了新的道路。3.3第二代測(cè)序技術(shù)2005年底R(shí)oche公司建立454測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合DNA擴(kuò)增乳膠和皮升級(jí)反應(yīng)孔進(jìn)行焦磷酸鹽測(cè)序，可對(duì)微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行研究，具有速度快、通量高、讀長(zhǎng)長(zhǎng)、準(zhǔn)確性高、一致性好及簡(jiǎn)便高效的優(yōu)勢(shì)。Gosalbes等24運(yùn)用454測(cè)序技術(shù)對(duì)10位健康人的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)厚壁菌門占49.18%,擬桿

7、菌門占31.42%,變形菌 門 占3.6%,放 線 菌 門 占0.4%.454測(cè)序技術(shù)在腸道微生態(tài)研究中已經(jīng)得到較為廣泛的運(yùn)用25,然而454測(cè)序同樣存在著缺點(diǎn)，主要在于片段長(zhǎng)度短，對(duì)連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)域測(cè)序準(zhǔn)確性差，常會(huì)產(chǎn)生缺失或者插入誤差。但隨著454測(cè)序分析技術(shù)的發(fā)展成熟，終將得到更準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果。相較于454測(cè)序技術(shù)，Illumina測(cè)序表現(xiàn)出低錯(cuò)誤率、低成本和高通量等優(yōu)勢(shì)26-27.但是，Illumi-na測(cè)序長(zhǎng)度短，所獲得的序列數(shù)量巨大，呈數(shù)十倍增長(zhǎng)，原有生物信息學(xué)分析工具無(wú)法計(jì)算，因此解決其運(yùn)算問題是Illumina用于微生物群落分析的關(guān)鍵之處。隨著Illumina測(cè)序讀取長(zhǎng)度的

8、改善及新型分析工具的開發(fā)，預(yù)計(jì)Illumina測(cè)序技術(shù)將因其高性價(jià)比的優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于腸道微生物組的研究。4展望從1975年Woese等首次應(yīng)用rRNA分析菌群以來(lái)，rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)迅速擴(kuò)大，16SrRNA基因作為細(xì)菌的標(biāo)志，已逐漸成為臨床細(xì)菌分類、鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)多以16SrRNA基因?yàn)榛A(chǔ)，Shot-gun測(cè)序費(fèi)用高昂且分析過程繁瑣復(fù)雜，目前難以大規(guī)模推廣使用，DGGE技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單高效，T-RFLP較為方便快捷?；蛐酒糜趥€(gè)體間腸道菌群對(duì)比時(shí)靈敏性較好，且具有高通量特點(diǎn)，預(yù)計(jì)可廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。宏基因組測(cè)序可保留樣本中全部菌群的信息，在腸道菌群多樣性研究中正逐漸盛行。焦磷酸

9、測(cè)序能自動(dòng)化檢測(cè)大量的樣本，近年來(lái)發(fā)展迅速。然而分子生物學(xué)技術(shù)均為多學(xué)科技術(shù)融合滲透的成果，必然在某些方面存在不足和一些亟待解決的關(guān)鍵問題，且這些方法都受制于樣本中獲得的DNA質(zhì)量及其PCR效果。但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相信這些問題會(huì)得到解決，相關(guān)技術(shù)一定會(huì)在腸道微生物的研究中發(fā)揮更加重要的作用?？傊?，腸道微生物組研究主要包括微生物組的多樣性和功能活性等兩方面。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的研究方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)是目前主要的兩大研究手段，其中現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)具有快速、高效的特點(diǎn)，尤其是對(duì)于不能被培養(yǎng)的微生物的研究具有傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì)。而傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，可通過培養(yǎng)、分離、鑒定獲

10、得存活的純微生物，進(jìn)而在微生物整體水平上進(jìn)行研究。因此，綜合應(yīng)用各種腸道微生物組的研究方法和技術(shù)才能進(jìn)一步加快對(duì)腸道微生物組多樣性及其功能的研究和認(rèn)識(shí)。參 考 文 獻(xiàn)1SERINO M,LUCHE E,GRES S,et al.Metabolic adapta-tion to a high-fat diet is associated with a change in the gutmicrobiotaJ.Gut,2012,61（4）：543-553.2SWARTZ T D,SAKAR Y,DUCA F A,et al.Preserved ad-iposity in the Fischer 344rat devoid of gut microbiotaJ.FASEB J,2013,27（4）：1701-1710.3ROUND J L,LEE S M,LI J,et al.The Toll-like receptor 2pathway establishes colonization by a commensal of the hu-