病理解剖技術(shù)

1、病理解剖學(xué)技術(shù) （The technique of Pathology,序： 病理學(xué)的理論和技術(shù)被視為一輛車(chē)的兩個(gè)車(chē)輪，缺一不可，互為依存，互相促進(jìn)，兩者的結(jié)合決定病理學(xué)的發(fā)展,病理學(xué)的技術(shù)主要體現(xiàn)在幾個(gè)結(jié)合上 1.傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)與現(xiàn)代生物新技術(shù)相結(jié)合 2.宏觀、臟器、組織、細(xì)胞、超微與分子基因不同層次技術(shù)相結(jié)合 3.形態(tài)、機(jī)能與代謝變化相結(jié)合 4.定性、定位與定量觀測(cè)相結(jié)合 5.實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)與臨床應(yīng)用技術(shù)相結(jié)合 6.技術(shù)的基本原理與具體方法相結(jié)合 7.基本技術(shù)知識(shí)與作者實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合,病理學(xué)的發(fā)展與使用的工具 和方法的更新密切相關(guān) 1.用解剖刀剪等進(jìn)行尸體檢查，開(kāi)展了器官病理學(xué) 2.顯微鏡發(fā)

2、明百年之后，建立了細(xì)胞病理學(xué) 3.電子顯微鏡的問(wèn)世，發(fā)展了超微病理學(xué) 4.免疫組織化學(xué)促進(jìn)了免疫病理學(xué)的發(fā)展 5.分子生物學(xué)帶動(dòng)了分子病理學(xué)的興起 6.計(jì)算機(jī)及其網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用，將病理學(xué)走向信息病理學(xué)時(shí)代,傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)： 傳統(tǒng)的Formalin固定，石蠟切片和HE染色技術(shù)仍是病理學(xué)的基本技術(shù)，大量應(yīng)用與基礎(chǔ)和臨床病理學(xué)日常工作中，保證和提高常規(guī)質(zhì)量和現(xiàn)代設(shè)備水平十分重要,第一章：病理解剖技術(shù) 一、病理解剖的意義 病理解剖技術(shù)是病理學(xué)的基礎(chǔ)之一，是病理學(xué)不可分割的一部分。 通過(guò)病理解剖收集病理教學(xué)及科研資料是其中一個(gè)途徑，大量病理資料的積累促進(jìn)了醫(yī)學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步。 病理解剖是通過(guò)解剖尸體觀察和發(fā)現(xiàn)

3、死者器官、組織的病理變化，找出主要病變，分析判斷直接死亡的一個(gè)重要方法,二、病理解剖室的設(shè)備和器械 1. 設(shè)備： 1解剖室的設(shè)計(jì)要求 最好位于太平間； 室內(nèi)面積要大，必須有兩個(gè)門(mén)； 地面用水磨石，四周有排水溝或地漏； 室內(nèi)通風(fēng)好； 有消毒室，男女更衣室，浴室等,2解剖臺(tái)的設(shè)計(jì) 高低和大小要合適 臺(tái)面可用水磨石或不銹鋼 有條件可購(gòu)置能夠升降的解剖臺(tái) 解剖臺(tái)可帶有抽氣的功能等,水磨石臺(tái)面的解剖臺(tái),水磨石臺(tái)面的解剖臺(tái),不銹鋼臺(tái)面的解剖臺(tái),病理解剖器械,2. 器械,3. 清潔、消毒和個(gè)人保護(hù) 1病理解剖室的清潔和消毒 2病理解剖器械的清潔和消毒 3個(gè)人保護(hù)等,三、病理解剖的方法和步驟 1. 病理解剖前

4、的準(zhǔn)備 主要辦理一切手續(xù)，非常重要。 2. 體表檢查,體表檢查,尸斑，尸僵,3. 胸腹腔檢查 1切口 2腹腔檢查 3胸腔檢查,腹腔有滲出液,心包積液（血液,氣管周?chē)?液體稱(chēng)量,4. 內(nèi)臟器官的取出及檢查 一般有兩種方法： 1各臟器分別取出法 是病理解剖最常用的方法 2多臟器聯(lián)合取出法 此法比較簡(jiǎn)單，可保持各器官的完整性,心臟,表面充血,絨毛心,雙肺和支氣管,肝臟,表面有結(jié)節(jié),胰腺，出血改變,腸管，出血,腦,腦干出血,第二章 病理大體標(biāo)本的制作 一、大體標(biāo)本的收集、取材、固定和保存 1.大體標(biāo)本的收集 通過(guò)尸體解剖和活體組織（包括外科手術(shù)切除標(biāo)本和活體組織穿刺標(biāo)本檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)并收集。 2.大體

5、標(biāo)本的取材,取材室條件： 通風(fēng)要好，必須有排風(fēng)設(shè)備； 固定的組織取材前要用流水充分沖洗； 排水要遠(yuǎn)離住宅區(qū)等,不同器官的取材和固定不同： 1實(shí)質(zhì)性的器官：如肝、脾等 要注意，實(shí)質(zhì)器官不容易被固定液所穿透,肝癌,肝癌,肝癌,肝癌,2空腔器官：如胃、腸等 取材時(shí)要看全層，保持粘膜、肌層和漿膜全層的組織,胃癌，呈菜花狀,切面的形狀,胃癌，潰瘍型,切面的形狀,切面的形狀，浸潤(rùn)性至漿膜,潰瘍型胃癌,潰瘍型胃癌,切面的形狀，浸潤(rùn)性至漿膜,3肺 肺組織比較疏松，固定液容易滲透。 肺組織的取材要清楚的了解各葉肺組織所伴隨的支氣管,A：主支氣管 B：葉支氣管,肺和氣管周?chē)牧馨徒Y(jié),肺癌 肺門(mén)型,肺癌 肺門(mén)與周?chē)?/p>

6、之間,肺癌 周?chē)?肺癌 空洞型,4）其它類(lèi)型 外科手術(shù)標(biāo)本常見(jiàn)： 乳腺癌 子宮頸癌 腸癌 卵巢腫瘤等,乳腺癌,乳腺癌,乳腺癌,乳腺癌,子宮頸癌,子宮頸癌,子宮頸癌,子宮頸癌，切面,3.大體標(biāo)本的固定 1固定的目的： 將受檢組織盡快地侵入固定液內(nèi)，使組織和細(xì)胞的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐敗，使其保持與生活狀態(tài)有相似的結(jié)構(gòu)，以利于切片和觀察。 2固定液的選擇： A.甲醛（Fomaldehyde，又稱(chēng)福爾馬林，其濃度在4，它是一種還原劑，極易揮發(fā)，散發(fā)出強(qiáng)烈的刺激性氣體，使人流鼻涕、流眼淚，呼吸道有異物感。 B.95酒精（乙醇，除具有固定組織的作用外，尚有脫水作用,3固定液的特性 甲醛固定液滲

7、透力強(qiáng)，固定均勻，對(duì)組織收縮較小，并能增加組織韌性的優(yōu)點(diǎn)，而且可以保存組織內(nèi)的脂類(lèi)物質(zhì)，對(duì)組織的主要作用為硬化和防腐。 酒精可以保存組織內(nèi)的糖類(lèi)物質(zhì)及尿酸結(jié)晶，不過(guò)，它常使組織明顯收縮，且使脂類(lèi)物質(zhì)溶解,4. 大體標(biāo)本的脫水、包埋和切片 為能制成滿意的切片，固定后的組織還要經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟及包埋等一系列程序。 1脫水：目的是將固定了的組織內(nèi)水分除去。以便使切片時(shí)的支撐物（石蠟充分進(jìn)入組織內(nèi)。常用的是酒精。 2透明：目的是使能與石蠟結(jié)合溶解的媒介劑進(jìn)入組織，進(jìn)而將不能與石蠟結(jié)合的脫水劑置換出來(lái)，并使組織透明。常用的是二甲苯,3浸透和包埋：可使組織具有一定的硬度和韌度，便于切成薄的切片。常用的

8、石蠟溶點(diǎn)為6062，有時(shí)為保存更多的抗原成分?？刹捎玫腿茳c(diǎn)石蠟（4850 。 4切片 切片機(jī)類(lèi)型： 旋轉(zhuǎn)式切片機(jī) 滑動(dòng)式切片機(jī),旋轉(zhuǎn)式切片機(jī),5. HE（Hematoxin Eosin,HE染色 1蘇木素染色配方： 蘇木素 1g 純酒精 10ml 鉀明礬 20g 蒸餾水 200ml 氯化汞 0.5g 2伊紅染色配方： 伊紅 0.5-1g 蒸餾水 99ml,HE染色法： 1蘇木素染色57分鐘； 2自來(lái)水沖洗多余的染液； 31鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘，使細(xì)胞核呈紫藍(lán)色 4自來(lái)水中充分洗滌； 51氨水中數(shù)秒，至返藍(lán)； 6自來(lái)水中至蒸餾水沖洗； 71的伊紅染色，3分鐘左右； 結(jié)果：細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞漿呈粉

9、紅色，基底膜，膠原纖維及肌纖維呈粉紅色,HE切片,第三章 特殊染色 HE染色雖是一種快速、經(jīng)濟(jì)、且易掌握的方法，但它不能回答病因?qū)W、Z組織發(fā)生及發(fā)病機(jī)制等方面的許多問(wèn)題。而特殊染色可以協(xié)助解決病理診斷問(wèn)題,目前市場(chǎng)上有配制好的特殊染色試劑,介紹常用的幾種特殊染色 1. 脂肪染色 主要用于心、肝、腎的脂肪變性，動(dòng)脈粥樣硬化，以及因脂肪栓塞導(dǎo)致的死亡病例鑒定等。 1試劑配制：蘇丹染液 蘇丹III或蘇丹IV0.5g，70%乙醇250ml，丙酮250ml。 2染色方法： （1標(biāo)本常規(guī)甲醛固定后流水沖洗12h； （2用濾紙吸干標(biāo)本表面的水分，把標(biāo)本放入蘇丹III染液中浸泡30min； （3用70乙醇分化

10、，以脂肪組織呈橙黃色，其它組織不著色為佳； （4水洗后浸存在5甲醛液中，為了防腐可加入適量的防腐劑,肝脂肪變,蘇丹III染色,2. 過(guò)碘酸(periodic acid)-schiff染色，即PAS染色 此技術(shù)主要顯示糖原（在淀粉酶消化對(duì)照下、中性粘液物質(zhì)、基底膜、霉菌和寄生蟲(chóng)等。 1 schiff氏試劑的配方： （1將200ml蒸餾水煮沸； （2冷卻至90時(shí)，慢慢加入堿性復(fù)紅1g; （3攪拌并煮沸5分鐘使其全溶； （4冷卻至50時(shí)過(guò)濾，并加入1N鹽酸20ml； （5冷卻至25時(shí)，再加入無(wú)水亞硝酸鈉1g并攪拌勻。 （6置入遮光瓶?jī)?nèi)并放入在4冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?2PAS染色方法： （11過(guò)碘酸水溶液染

11、10分鐘，使含有乙二醇的化合物氧化形成醛基； （2蒸餾水洗去過(guò)碘酸； （3 schiff氏試劑反應(yīng)15分鐘，使醛基和schiff氏試劑結(jié)合，形成紫紅色產(chǎn)物； （40.5%亞硝酸鈉(NaHSO3)處理三次，每次2分鐘； （5流水沖洗510分鐘； （6用蘇木素染色液復(fù)染細(xì)胞核； 7水洗或1鹽酸酒精分化。 3結(jié)果： 細(xì)胞核呈藍(lán)色，基底膜呈紅色，膠原纖維、肌纖維及細(xì)胞漿呈紅色,過(guò)碘酸Schiff反應(yīng)：糖元及其他PAS反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色,PAS,念珠菌（PAS染色,附：AB/PAS法（阿爾辛藍(lán)過(guò)碘酸雪夫染色法 結(jié)果：中性粘液物質(zhì)呈紅色，酸性粘液物質(zhì)呈藍(lán) 色，中性和酸性粘液的混合物質(zhì)呈紫色,

12、阿爾辛藍(lán)阿爾辛黃法：常用于黏液上皮腫瘤的鑒別診斷,阿爾辛藍(lán)過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)：是顯示中性和酸性黏液物質(zhì)的有效方法,HID/AB:高鐵二胺奧新藍(lán)法,AB/PAS,3. 六胺銀（PASM染色 在腎臟活體組織檢查和一些真菌感染的組織選用此方法。 1PASM染液的配方： 2硝酸銀水溶液3ml； 3六次甲基四胺液25ml； 5硼砂2ml。 注：2硝酸銀配制胺溶液，染色時(shí)間40分鐘，溫度 5560，隨時(shí)鏡下觀察便于控制,2PASM染色法： （11過(guò)碘酸水溶液內(nèi)染10分鐘； （2自來(lái)水沖洗，蒸餾水沖洗； （3入5鉻酸水溶液40分鐘，出此溶液后用1亞硫酸鈉除掉鉻酸； （4自來(lái)水洗數(shù)次，蒸餾水洗34次； （5入六胺

13、銀染液（506040分鐘，20分鐘后，每5分鐘鏡下觀察一次，蒸餾水洗四次； （6入0.2%氯化金水溶液12分鐘，蒸餾水洗三次； （7入5硫代硫酸鈉水溶液12分鐘，蒸餾水洗數(shù)次； （8復(fù)染HE，脫水、透明、封片 結(jié)果：底膜呈黑色，網(wǎng)狀纖維呈黑色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，背景呈粉紅色,PASM染色,PASM染色,PASM,PASM,附：PASM對(duì)真菌的染色 真菌（fungus，又稱(chēng)霉菌，其種類(lèi)較多。 真菌的基本結(jié)構(gòu)成分是含有較多的粘多糖和蛋白質(zhì)。 1試劑的配制： （1六次甲基四胺、硝酸銀原液（簡(jiǎn)稱(chēng)六胺銀原液。3六次甲基四胺水溶液100ml，5硝酸銀水溶液5ml； （2六胺銀硼砂染色液。六胺銀原液25ml，蒸

14、餾水25ml，5硼砂水溶液2ml； （3核固紅染液。核固紅0.1g，硫酸鋁5g，蒸餾水100ml； （4亮綠染色液。亮綠0.2g，蒸餾水100ml，冰醋酸0.2ml,2染色步驟： （15鉻酸水溶液氧化1小時(shí)，流水洗2分鐘，蒸餾水洗2次； （2浸入1亞硫酸鈉水溶液除掉鉻酸1分鐘，流水洗5分鐘，蒸餾水洗3次； （3浸入六胺銀硼砂液染色11.5小時(shí)（4050溫箱內(nèi)，至切片呈淺棕色，蒸餾水3次； （4用0.2%氯化金水溶液調(diào)色3分鐘，蒸餾水稍洗； （5核固紅染色細(xì)胞核10分鐘，流水洗，蒸餾水洗； （6亮綠染色液30秒，用蒸餾水快速稍洗； （7無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。 結(jié)果：真菌均呈黑色

15、，菌絲和孢子呈黑褐色，細(xì)胞核呈紅色，背景呈淡綠色,念珠菌（假菌絲,新生隱球菌性腦膜炎,4. 淀粉樣物質(zhì)染色（介紹剛果紅染色） 淀粉樣物質(zhì)是一種嗜伊紅性物質(zhì)，性質(zhì)屬于糖蛋白成分。組織出現(xiàn)此物質(zhì)稱(chēng)為淀粉樣變性。 1試劑配制： （1剛果紅染色液。剛果紅1g，蒸餾水100ml； （2Harris蘇木素染色液,2染色步驟： （1蘇木素染色液浸染2分鐘； （20.5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘； （3流水洗，蒸餾水洗2次； （4剛果紅染色液中25分鐘； （5無(wú)水乙醇迅速脫水2次； （6二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。 結(jié)果：淀粉樣物質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色,剛果紅染色,5. Mallory三色染色法（屬于結(jié)締組織復(fù)合染色

16、法 1試劑配制： （1重鉻酸鉀液。重鉻酸鉀2.5g，醋酸5ml，蒸餾水95ml； （2苯胺藍(lán)橘黃G液。苯胺藍(lán)0.5g，橘黃2g，磷鎢酸1g，蒸餾水100ml； （3酸性復(fù)紅液。酸性復(fù)紅0.5g，蒸餾水100ml,2染色步驟： （1重鉻酸鉀液10分鐘； （2流水洗2分鐘，蒸餾水洗2次； （3酸性復(fù)紅液2分鐘，蒸餾水稍洗； （4苯胺藍(lán)液20分鐘，95乙醇快速分化； （5直接用無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。 結(jié)果：膠原和網(wǎng)狀纖維呈藍(lán)色，軟骨、粘液、淀粉樣變性物質(zhì)呈淡藍(lán)色，神經(jīng)膠質(zhì)纖維、肌纖維和酸性顆粒呈紅色，髓鞘和紅細(xì)胞呈橘紅色,特點(diǎn)：利用酸性復(fù)紅、苯胺藍(lán)、橘黃G這三種染料對(duì)結(jié)締組織和非結(jié)

17、締組織進(jìn)行著色,Mallory,6. Masson三色染色法 1試劑配制 （1Masson復(fù)合染色液。堿性復(fù)紅1g，麗春紅2g，橘黃G2g，0.25%醋酸300ml； （2）亮綠染色液。亮綠SF0.1g，0.2%醋酸100ml。 2染色步驟 （1 Masson復(fù)合染色液5分鐘； （2 0.2%醋酸水溶液稍洗； （35磷鎢酸510分鐘； （4 0.2%醋酸水溶液浸洗2次； （5亮綠染色液5分鐘； （6 0.2%醋酸水洗2次； （7無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固,結(jié)果： 細(xì)胞核呈紅色，基底膜、膠原纖維呈藍(lán)綠色，免疫復(fù)合物呈紅色,適用于腦垂體、上皮、甲狀腺、神經(jīng)的正常和腫瘤組織,Masson

18、,腎小球,左：HE染色 右：Masson染色，膠原組織呈藍(lán)色，彈力纖維棕色，肌纖維、 纖維素、紅細(xì)胞呈紅色，胞核呈黑藍(lán)色,7. 彈力纖維染色法 病理診斷應(yīng)用彈力纖維染色，目的是觀察組織內(nèi)彈力纖維是否增生或破壞、斷裂和崩解，從而幫助診斷。 試劑配制： 地衣紅酒精液 1g 70%酒精 100ml 濃鹽酸 1ml 結(jié)果：Taner-Unna法，彈力纖維呈深棕紅色。 Verhoeff鐵蘇木素染色法，彈力纖維呈黑色,Verhoeff鐵蘇木素染色法：彈力纖維黑色或黑藍(lán)色，胞核黑色，膠原纖維呈紅色,Verhoeff鐵蘇木素染色法,Lendrum纖維素染色法 顯示腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)血栓形成,免疫組織化學(xué)技術(shù),

19、第四章,免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry） 一定義： 應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位、或定量研究，這種技術(shù)稱(chēng)免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry） 或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry），簡(jiǎn)稱(chēng)免疫組化。免疫組化技術(shù)是1941年 Coons等學(xué)者首創(chuàng)的，隨著其理論及技術(shù)的發(fā)展，目前已發(fā)生了日新月異的變化,1免疫組化的方法： 1）直接法 2）間接法： SPA、 PAP、 ABC、 LAB法等，間接法 的靈敏度高于直接法。 2標(biāo)記的物質(zhì)：熒光染料、放射性同位素，酶（辣根過(guò)氧 化物酶、堿性磷酸

20、酶等）鐵蛋白、膠體金等。 3根據(jù)標(biāo)記物區(qū)分：免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和 免疫金銀法。其中免疫熒光法和酶標(biāo)法應(yīng)用 廣泛,反差,二免疫組化的基本知識(shí) 1原理：抗體與抗原間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫紐織化學(xué)正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以此作為抗原或半抗原，通過(guò)免疫后獲得特異性抗體，再以此抗體去探測(cè)組織或細(xì)胞中的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無(wú)色的，因此還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(lái)，以期達(dá)到對(duì)組化或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性、定位甚至定量的研究。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、

21、激素、核酸及病原體等，都可以用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè),2.抗原性的保存：上述談到的抗原或半抗原物質(zhì)，防止在組織或細(xì)胞內(nèi)丟失是非常重要的。在組織處理過(guò)程中，如固定、包埋、薄切、反應(yīng)，必須保持其抗原性，特別是選擇的固定液及包埋方法要十分注意。 3.抗體：抗體是機(jī)體受抗原刺激后，由B淋巴細(xì)胞、特別是漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的一種球蛋白，即免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig)，共有五類(lèi)：IgG, IgA, IgM, IgD, 和IgE，主要分布在血清或外分泌物中，以IgG為主，約占7080,1抗體的制備方法： A 多克隆抗體（血清抗體：指機(jī)體接受抗原主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后從血

22、清中分離提純的抗體。 B 單克隆抗體：是1975年由Kohlenh Milstein發(fā)明的一種新技術(shù)。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞和免疫的脾細(xì)胞相融合，產(chǎn)生雜交細(xì)胞。這種融合的雜交細(xì)胞既有骨髓細(xì)胞的無(wú)限生長(zhǎng)能力，又有漿細(xì)胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細(xì)胞純化，成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專(zhuān)一的高純度的抗體，即單克隆抗體（monoclonal antibody,McAb,2) 單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較 特性 多克隆 單克隆 組成 多種類(lèi)抗體的混合物 單一種類(lèi)的抗體 特異性 低針對(duì)多個(gè)抗原決定族 高針對(duì)單一的抗原決定族 親和力 平均親和力較高 不定，較低 交叉反應(yīng) 高 低,4抗原與抗體的特異

23、性結(jié)合 抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。在抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)中有3個(gè)特殊的易變部位，即在第30位、50一60位和第100位氨基酸殘基附近，這些部位稱(chēng)為超變區(qū)。超變區(qū)直接參與抗原接合部位的組成，形成的接合部位是一個(gè)淺平穴槽，槽大小約I.5nm0.6nm0.6nm抗原決定族在空間呈互補(bǔ)性地嵌入槽內(nèi)，借分子間的范德華力、疏水作用靜電引力以及氫鍵而相互結(jié)合?？乖c抗體分子的結(jié)合不受兩者數(shù)量比例的限制，但如要出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)， 則抗原與抗體的量需有一定的適當(dāng)?shù)谋壤?，否則在抗原與抗體過(guò)量的情況下，不能聚合成大顆粒，因此不能出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng),三免疫組織化學(xué)的基本技術(shù) （一 取材 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：麻醉

24、 （處死，鋒利刀片切成大小適中， 厚度3mm4mm; 小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：灌注（流）固定（生理鹽水和4多聚甲醛 取材 2人體材料：活檢組織、手術(shù)標(biāo)本、細(xì)胞和組織,二）固定：原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測(cè)抗原的前提下，應(yīng)采用濃度最低的固定劑和最短的固定時(shí)間，固定時(shí)間一般為112h。 1常用的固定劑： 1）甲醛緩沖液：廣泛應(yīng)用于病理標(biāo)本的固定，甲醛在很好地保護(hù)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的同時(shí)也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交聯(lián)作用會(huì)影響被固定細(xì)胞膜的通透性不利于染色時(shí)抗體的滲透，因此染色前常用酶進(jìn)行消化以使抗原決定簇充分暴露，固定時(shí)間不直超過(guò)24h,2）4多聚甲醛磷酸緩沖液：廣泛應(yīng)用于光鏡細(xì)胞化學(xué)研究。 3）戊二

25、醛多聚甲醛緩沖液：適用于光鏡、電鏡免疫組織化學(xué)研究。 4）其它：如PLP液（過(guò)碘酸賴(lài)AA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇類(lèi)、鋨酸等,2固定注意事項(xiàng)： 1）固定液的選擇標(biāo)準(zhǔn)：A. 組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好；B. 最大限度 保存抗 原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應(yīng)用最廣的固定劑。 2）組織塊的大小：1.5cm1.5cm0.5cm為宜。 3）固定時(shí)間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成 反比。 4）溫度：一般在室溫下進(jìn)行，電鏡標(biāo)本和固定時(shí)間較長(zhǎng)時(shí) 可放置在4 冰箱。 5固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑,三）包埋：1.石蠟包埋；2.冷凍包埋；3.環(huán)氧樹(shù)脂包理。 （四）切片：1.載玻片的處理： 1）清洗 ；

26、2）涂膠（防止脫片） 常用粘附劑：明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠；樹(shù)脂膠： 也稱(chēng)白膠； 多聚賴(lài)氨酸（PLL）；商品化粘附劑。 2.切片類(lèi)型： l）石蠟切片：厚約 3 5 m放置 37 溫箱烘烤過(guò)夜， 以減少脫片。 2）冷凍切片：2 m。 3）振動(dòng)切片：特點(diǎn)是組織經(jīng)固定后不需包埋，只要用膠水粘在 載物臺(tái)上即可切片。切片較厚，可將陽(yáng)性部位作電鏡包埋。 神經(jīng)組織應(yīng)用 較多,四免疫組化染色過(guò)程中的基本技術(shù) （一）蛋白酶消化技術(shù) 進(jìn)行固定時(shí)，抗原決定簇有可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應(yīng)前，常用蛋白酶處理組織切片，使抗原決定簇充分暴露出來(lái)，并使組織的通透性增高，以利抗原抗體最大限度地結(jié)合增強(qiáng)特異性染色。

27、1常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶 2消化時(shí)間：因組織而異，一般為530分鐘，消化時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以免損傷組織形態(tài)，破壞抗原決定族。消化結(jié)束后要充分洗滌，以除去殘留的蛋白酶,1）非特異染色的控制 非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過(guò)程中凡不屬于特異性抗原抗體反應(yīng)所出現(xiàn)的染色。 1原因分析： 組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶或堿 性磷酸酶、內(nèi)源性生物素等； 試劑方面：因抗體不純、標(biāo)記的酶和熒光不純或標(biāo)記過(guò)量等。 2消除方法： A. 加 1抗前加正常血清1030分，以封閉組織中帶電荷的基 因，避免與1抗的非特異性結(jié)合,B . 減少非特異性染色： a 免疫酶組化染色時(shí)，在加1抗前，

28、用0.3的H2O2甲醇溶 液將組織切片處理30分（若是3的H2O2甲醇溶液處 理510分）。 b 免疫熒光染色時(shí)，可用0.010.05伊文思藍(lán)稀釋熒光 抗 體。 （二）對(duì)照實(shí)驗(yàn) 陽(yáng)性對(duì)照片：用已知抗原為陽(yáng)性的標(biāo)本作對(duì)照。 陰性對(duì)照片：確認(rèn)不含己知抗原的標(biāo)本作對(duì)照,三）抗體的分裝、稀釋、滴加及保存 1抗體的分裝：不能用完的抗體分裝在小的EP管內(nèi)，保存在 -20 - 40 的低溫冰箱中持用可保持?jǐn)?shù)年有效。 2抗體稀釋?zhuān)撼Ｓ?0.01M PBS（磷酸緩沖溶液）或 BSA （牛血清白蛋白） 3滴加：滴加的抗體要充分覆蓋組織切片，一般加 3050l，最好在滴加前，用蠟筆或特制的組化筆在組織周?chē)?huà)一圈，以

29、防溶液的擴(kuò)散。 4保存：未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存，已稀釋未 用完的抗體最好在一周內(nèi)用完，不宜長(zhǎng)期保存,四）免疫酶組織化學(xué)技術(shù)和酶標(biāo)抗體技術(shù) 1免疫酶染色原理： 用酶作為標(biāo)記物，可分為直接法、間接法、補(bǔ)體法、免疫 酶橋法、免疫酶雙橋法、過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法 （PAP法）和雙PAP法等。 1）直接法原理：用酶直接標(biāo)記在特異性1抗上，與標(biāo)本中的 抗原結(jié)合，讓酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉淀在抗原 抗體反應(yīng)部位，即可在鏡下對(duì)標(biāo)本的抗原進(jìn)行檢測(cè)。 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)；缺點(diǎn)：敏感性差,2）間接法原理：先用標(biāo)記的特異性1抗與標(biāo)本中相應(yīng)抗原結(jié) 合，再用酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體（2抗）孵育，然

30、后再加 酶的底物，顯示抗原抗體抗原抗體復(fù)合物存在的部 位，以對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè)。 如：1抗是由免產(chǎn)生的多克隆抗體： 則2抗常用羊抗兔IgG； 如：1抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體： 則2抗常用羊或馬抗鼠IgG。 以上兩種方法稱(chēng)為酶標(biāo)抗體法,3）非酶標(biāo)記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動(dòng)物，產(chǎn)生抗酶的抗體。通過(guò)酶與抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記。該方法適用于石蠟包埋的組織切片。 原理：首先用酶作為抗原免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，然后以2抗為橋梁，將在組織中與抗原結(jié)合的lffo抗酶抗體連接起來(lái)，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)呈色反應(yīng)顯示抗原的分布。在這種過(guò)程中酶是通過(guò)免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合，避免了酶標(biāo)時(shí)化

31、學(xué)反應(yīng)對(duì)抗體和酶活性的破壞。不但提高了敏感性，同時(shí)還節(jié)省了1抗的用量。 常用的有PAP、sABC、LsAB法（附圖表說(shuō)明,酶標(biāo)識(shí)特異抗體,酶標(biāo)識(shí)二次抗體,生物素,HRP,ALP,1常用的酶種類(lèi)： 常用的酶大多為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）介紹幾種酶的底物及產(chǎn)生沉淀的顏色。 常見(jiàn)的幾種酶的一般情況 酶 底物 沉淀顏色 HRP A 3,3氨基聯(lián)苯胺DABH2O2 深褐色 B 5氨基水楊酸 H2O2 棕色 ALP A 苯酚磷酸鹽重氮鹽 紅色 B P校際酚磷酸鹽 黃色 酸性磷酸酶 Gomoui液 葡萄糖氧化酶 D葡萄糖MTT酚嗪磷酸 甲酯化合物 藍(lán)色,五免疫

32、組化的實(shí)際操作 （一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 1. 必須器材： 1）實(shí)驗(yàn)臺(tái)：光線充足，方便操作。 2）濕潤(rùn)盒：放置抗原抗體反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)，避免干燥。 3微量移液器：120 l、20200 l 、1001000 l必備。 4其它：濾紙、紗布、吸頭、EP管、染缸、提籃等。 2.試劑藥品 1緩沖液：PBS, 0.01 M 磷酸緩沖液（pH7.2） TBS, 0.05 M Tris鹽酸緩沖液（pH7.6） 2抗體稀釋液: 1 BSA或 0.01 M PBS 310 2抗免疫動(dòng)物的正常血清 4DBAH2O2顯色液 5核復(fù)染液：蘇木素或甲基綠,二 sABC法的操作過(guò)程 1. 基本原理：sABC（strepto-avid

33、in-biotin peroxidase complex）鏈球菌抗生物素（卵白蛋）生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物 生物素（ biotin）：是一種分子量為 244da的小分子的維生素。 抗生物素（avidin）：是一種糖蛋白，分子量為 68KDa。 生物素與抗生物素有很強(qiáng)的親和力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時(shí)生物素與抗生物素都有與其它示蹤劑如熒光素，膠體金和過(guò)氧化物酶等相結(jié)合的能力。所以生物素-抗生物素系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)及方便快速等顯著優(yōu)點(diǎn)。 基本操作步驟,六操作過(guò)程中的各種注意事項(xiàng)及結(jié)果判定 要想得到理想的結(jié)果，組織細(xì)胞形態(tài)的保存、抗原性的保存、充分的顯示是非常必要的。要滿足這些條件，取材、

34、固定、切片厚度、操作過(guò)程、抗體濃度及特異性的選擇、操作前蛋白酶的消化、抗原修復(fù)及顯色等各程序的操作不當(dāng)均可導(dǎo)致不滿意結(jié)果的產(chǎn)生。 1取材固定：標(biāo)本要盡可能新鮮，取材固定要及時(shí)，固定液要新 鮮充足，防止組織破壞和抗原性的失活。 2切片：切片不宜過(guò)厚，一般4m左右。切片不宜過(guò)大，載玻片要涂粘附劑，以防脫片。切好的切片暫放 37 溫箱保存,3脫蠟：脫蠟一定要徹底，新鮮二甲苯 5min 3。 4蛋白酶消化：由于組織在固定時(shí)抗原決定簇可能被固定 劑所封閉，因此在抗原抗體反應(yīng)前常用蛋白酶處理組織 切片（根據(jù)1抗要求），使抗原決定簇充分暴露出來(lái)，并 使組織通透性增高，使抗體充分結(jié)合抗原，增強(qiáng)特異性 染色。一

35、般用0.1% 胰蛋白酶或胃蛋白酶消化530min。 5抗原修復(fù)：一般在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液內(nèi)，微波爐， 8595，10min左右,6抗體的選擇：選擇抗體時(shí)要注意是用于冰凍切片還是用于 石蠟切片的抗體，或是二者均可；其次要看抗體說(shuō)明，是 單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來(lái)源于哪種動(dòng)物， 由此來(lái)選擇2抗；還有抗體的稀度（在實(shí)驗(yàn)前根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn) 選擇最佳濃度。 7特異性的確定：陰性對(duì)照（不加 1抗，用PBS或TBS代 替），陽(yáng)性對(duì)照（已知確定陽(yáng)性的組織）或買(mǎi)陽(yáng)性對(duì)照片,8DABH2O2顯色：注意H2O2的濃度，必須在顯示前加入 H2O2均勻攪拌，最佳顯色時(shí)間在35min，過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都 不會(huì)出現(xiàn)滿意的效果

36、。 9復(fù)染：一般用蘇木素30s，過(guò)長(zhǎng)復(fù)染將掩蓋免疫組化的染 色效果。 10結(jié)果判定：以下用圖片說(shuō)明,膜性腎病，IgG染色,免疫組織化學(xué)ABC法,胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 cerbB-2癌基因表達(dá) sABC法,HE染色,免疫組化染色,胃癌，P53抑癌基因表達(dá)， sABC法,胃癌CerbB-2的表達(dá)， sABC法,胃癌cerbB-2的淋巴管侵襲， sABC法,胃淋巴組織反應(yīng)性增生，CD20/CD43檢測(cè) sABC法,胃組織中的反應(yīng)性增生的淋巴組織，CD43表達(dá)， sABC法,骨骼肌營(yíng)養(yǎng)不良，myosin蛋白表達(dá)， sABC法,IgAN，TGF2表達(dá)，主要在近曲腎小管內(nèi)， sABC法,IgAN, TGF2的表

37、達(dá)，sABC法,IgAN，bFGF的表達(dá)， sABC法,IgAN, PDGF的表達(dá)， sABC法,免疫組織化學(xué)在病理診斷中的應(yīng)用范圍 1.腫瘤診斷： 未分化惡性腫瘤性質(zhì)判定； 圓形、梭形、多形性腫瘤細(xì)胞鑒別； 轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位的確定。 2.淋巴瘤的診斷： 鑒定反應(yīng)性增生疾病與淋巴瘤； 各種淋巴瘤的分型,3.內(nèi)分泌腫瘤的診斷（檢測(cè)腫瘤分泌的激素 4.軟組織腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤 5.小活檢組織病理檢查（能明確顯示瘤細(xì)胞存在與否 6.微小癌、微小轉(zhuǎn)移灶（淋巴結(jié)和骨髓 7.細(xì)針穿刺（細(xì)胞學(xué)診斷,8.部分腫瘤來(lái)源分類(lèi) 9.乳腺癌激素受體檢測(cè)（ER，PR 10.腫瘤基因產(chǎn)物（p53,cerb-B2,ALK

38、,CDs) 11.增殖細(xì)胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定腫瘤的預(yù)后 12.病因診斷（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等,免疫組織化學(xué)在病理診斷中存在的不足 1.與分子生物學(xué)等技術(shù)相比，范圍有限 2.并非所有腫瘤均可以做免疫組化，因常無(wú)相應(yīng)的 抗體 3.相當(dāng)多的腫瘤缺乏特異性抗原的表達(dá)，同一種抗 體，常?？杀磉_(dá)多種腫瘤 4.免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題,免疫電鏡技術(shù),哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理教研室 金曉明,一、免疫電鏡技術(shù)(immunoelection microscopy,IEM) 是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平定位、定性及半定量顯示抗原的技術(shù)方法。從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察

39、抗原抗體的免疫反應(yīng)，必須使抗體帶上具有高電子密度的標(biāo)記物，這樣才能在電鏡下觀察反應(yīng)分結(jié)果。 到目前為止，已有三種標(biāo)記技術(shù)： (1)鐵蛋白標(biāo)記技術(shù) (2)酶標(biāo)記技術(shù) (3)膠體金標(biāo)記技術(shù),二、免疫金標(biāo)記技術(shù)（immunogold staining technique) 用膠體狀態(tài)的金顆粒，作為抗體的標(biāo)記物，制成免疫膠體金來(lái)研究抗原抗體的反應(yīng)。在光鏡下，膠體金呈鮮紅色。電鏡下，金顆粒電子密度大，有利于超微結(jié)構(gòu)的觀察。 根據(jù)抗體特異性結(jié)合的原理，在亞細(xì)胞水平定性定位。對(duì)抗體加以標(biāo)記，形成高電子密度區(qū)，在電鏡下觀察反應(yīng)過(guò)程。在對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原定性研究中，還可用不同的金顆粒標(biāo)記同一細(xì)胞內(nèi)不同的抗原。進(jìn)行多重

40、標(biāo)記,三、免疫電鏡的基本技術(shù)方法 1.標(biāo)本的處理 (1)取材:各種培養(yǎng)細(xì)胞和分離的血細(xì)胞應(yīng)隨用隨取；游離的培 養(yǎng)細(xì)胞可先進(jìn)行離心；貼壁細(xì)胞可在載玻片上固定， 也可用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)；取組織塊時(shí)應(yīng)做到 越快越好，最好在沒(méi)有停止血流前取材,2）固定 固定液的選擇： 既要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，又要盡可能的保存抗原的活性。 A.多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液（PG固定液） B.過(guò)碘酸鹽賴(lài)氨酸多聚甲醛混合固定液（ PLP固定液） C.苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液（PAPG固定液) 固定方法與時(shí)間： A.血管灌注固定（最好方法） B.浸泡固定 C.微波固定,2.基本技術(shù)方法 （1）包埋前免疫電鏡技術(shù) 是

41、指先對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫標(biāo)記，然后進(jìn)行包埋、切片、觀察。 （2）包埋后免疫電鏡技術(shù) 是指組織標(biāo)本經(jīng)固定及樹(shù)脂包埋，制作成超薄切片后再進(jìn)行免疫化學(xué)染色方法。 詳見(jiàn)包埋前和包埋后電鏡技術(shù)的比較,包埋前與包埋后的比較,肝細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，可見(jiàn)G-6-P酶陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物。 (32000,肝細(xì)胞。箭頭指線粒體，線粒體嵴、內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)呈現(xiàn)琥珀酸脫氫酶陽(yáng)性反應(yīng)顆粒（36000,IgAN, TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法,IgAN, TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法,K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機(jī)聯(lián)合的免疫電鏡法 （實(shí)驗(yàn)結(jié)果介紹,免疫電鏡技術(shù)是從超微結(jié)構(gòu)水平能顯示抗原和抗體結(jié)合后在細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)水平的定位，這一技術(shù)已成

42、為目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要研究手段。但是，由于免疫電鏡技術(shù)因多種原因造成的重復(fù)性差或技術(shù)的不穩(wěn)定性，加之目前電鏡包埋所采用的是環(huán)氧樹(shù)脂618或812，都需高溫聚合，這樣可使多種抗原活性減低或喪失。本研究組選用了Lowicryls K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機(jī)（SPI#17020），對(duì)免疫電鏡觀察的標(biāo)本進(jìn)行了處理，目的是更好的保存被檢測(cè)組織中抗原的活性，提高檢出率?，F(xiàn)將一些不成熟的經(jīng)驗(yàn)和存在的問(wèn)題進(jìn)行一下總結(jié),一、紫外線低溫包埋機(jī)（SPI#17020,SPI#17020是美國(guó)特殊研制的低溫包埋機(jī)，它最主要的特點(diǎn)是采用數(shù)字化溫度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，溫度可以控制在-

43、10-37之間。通過(guò)溫度控制風(fēng)扇可以使機(jī)內(nèi)的溫度控制在某一恒定溫度，持續(xù)長(zhǎng)達(dá)36小時(shí)，完全可以滿足低溫脫水、浸透和包埋所需的時(shí)間。它占地面范圍小，但機(jī)內(nèi)空間較大，可以同時(shí)放入72個(gè)包埋膠囊。而且機(jī)箱上方有兩個(gè)封閉起來(lái)的波長(zhǎng)為360nm的紫外燈，低溫和室溫下的紫外線聚合都可以在包埋機(jī)中進(jìn)行。 總之，紫外線低溫包埋機(jī)是很理想的低溫脫水、浸透、聚合的機(jī)器,二、Lowicryls K4M 低溫包埋劑 Lowicryls K4M是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學(xué)物質(zhì)，其特點(diǎn)是能在低溫下保持低粘度，能很快滲入組織以及具有在波長(zhǎng)360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無(wú)關(guān)，而且Lowicryls

44、K4M具有親水性，因此它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色,三、方法 1.包埋劑的配制 商品提供的Lowicrys K4M包埋劑由三個(gè)部分組成：?jiǎn)误w，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。調(diào)整單體和交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下： （1）Lowicryls K4M：?jiǎn)误w 17.30g；交聯(lián)劑2.70g；引發(fā)劑0.10g。可量取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻璃棒輕攪35分鐘。勿過(guò)分?jǐn)嚢?，以防空氣的氣泡進(jìn)入包埋劑中。 （2）Lowicryls K4M的貯存：應(yīng)保存在暗處室溫下，該物質(zhì)有刺激性，在配制時(shí)應(yīng)戴手套，以免觸及皮膚。在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，以免蒸氣刺激眼睛。如

45、觸及皮膚和眼睛，應(yīng)立即以水沖洗局部,2.組織和細(xì)胞的取材、固定、處理 （1）組織的取材與固定：用銳刀將新鮮組織切成13mm3的小塊, 迅速置于3%多聚甲醛- 1%戊二醛固定液中, 23h。 （2）細(xì)胞的取材與固定：將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心15min，使細(xì)胞聚成團(tuán)塊，棄去上清夜，換上3%多聚甲醛1%戊二醛固定液固定23h,3）組織或細(xì)胞處理過(guò)程 將固定好的標(biāo)本用0.01mol/L 磷酸緩沖液沖洗, 10min3次；用0.5mmol/L NH4CL-0.1mmol/L PB（pH7.4）封閉游離的醛基30min； 0.01mol/L 磷酸緩沖液1h；4 30%,50%乙醇脫水30min； -20乙醇系列逐級(jí)脫水至100%，各1h（乙醇溶液應(yīng)先在冰箱中預(yù)冷）。-20低溫包埋劑逐級(jí)滲透 , 純包埋劑浸透過(guò)夜。標(biāo)本放入含包埋劑的膠囊