玉米WRKY轉(zhuǎn)錄因子Ⅱd亞族抗逆相關(guān)基因的鑒定及ZmWRKY17的功能分析

1、玉米 WRKY轉(zhuǎn)錄因子 d 亞族抗逆相關(guān)基因的鑒定及ZmWRKY17的功能分析玉米是世界范圍內(nèi)重要的糧食作物之一, 是公認(rèn)的黃金食物。但是其生長發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)受到干旱、 鹽漬等非生物脅迫的嚴(yán)重影響, 挖掘抗逆相關(guān)基因 , 研究其逆境應(yīng)答機制 , 培育抗逆性較強的玉米新品種是應(yīng)對逆境脅迫, 提高玉米產(chǎn)量的最有效途徑。近些年的研究表明 , 轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答方面起著非常重要的作用。過量表達(dá)一個特定的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控下游多個抗逆相關(guān)基因的表達(dá),從而達(dá)到對作物進(jìn)行綜合改良的效果。WRKY蛋白家族是目前研究比較熱門的逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 其家族成員尤其是 d 亞族成員廣泛參與了植物

2、對各種脅迫的應(yīng)答反應(yīng)、生長發(fā)育、代謝調(diào)控等一系列生理活動。本研究首先對玉米中d 亞族 WRKY基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式、轉(zhuǎn)錄活性、以及鈣調(diào)素結(jié)合特性等分子特征進(jìn)行了系統(tǒng)分析。從玉米中克隆了脅迫相關(guān)關(guān)鍵基因ZmWRKY17,通過過量表達(dá)技術(shù)對ZmWRKY17在轉(zhuǎn)基因植物中的抗逆功能進(jìn)行了驗證, 并利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對其作用機制進(jìn)行了初步探索, 獲得了如下主要結(jié)果 :1. 對玉米中 12 個 d 亞族 WRKY基因的分子特性進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn) , 玉米中 7 個 d 亞族 WRKY基因的表達(dá)均受到干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)?？寺〉玫狡渲?6 個基因。酵母轉(zhuǎn)錄活性分析表明這6 個 d 亞族 WRKY基因在酵母

3、中均不具有轉(zhuǎn)錄激活能力。酵母雙雜交實驗表明 ,6 個 d 亞族 WRKY蛋白均能夠與鈣調(diào)素發(fā)生相互作用。2. 根據(jù)進(jìn)化關(guān)系和誘導(dǎo)表達(dá)模式分析結(jié)果, 選取了 ZmWRKY17作為關(guān)鍵基因進(jìn)行下一步的功能分析。序列分析顯示 ,ZmWRKY17基因 cDNA全長為 996bp, 編碼 331 個氨基酸 , 與玉米B73 數(shù)據(jù)庫中公布的序列完全一致。通過熒光定量PCR進(jìn)一步對 ZmWRKY17的表達(dá)特性進(jìn)行分析 , 發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)還受到外源ABA的誘導(dǎo)。組織表達(dá)模式分析顯示 ,ZmWRKY17在根、莖、葉、花絲、雄穗、果穗和胚7個組織中均有表達(dá) , 其中以雄穗中的表達(dá)水平最高。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示 ,

4、ZmWRKY17-GFP的融合表達(dá)蛋白定位在細(xì)胞核中。酵母單雜交實驗表明 ,ZmWRKY17能夠與 W-box序列發(fā)生特異性的結(jié)合。 3. 構(gòu)建了 ZmWRKY17過量表達(dá)載體 , 并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了多個擬南芥轉(zhuǎn)基因株系。對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行了抗鹽表型鑒定實驗, 結(jié)果表明 : 在高鹽脅迫處理后 , 轉(zhuǎn)基因植株的相對電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量均明顯高于野生型植株,說明過量表達(dá) ZmWRKY17提高了轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫的敏感性。4.ABA敏感性實驗顯示 ZmWRKY17的過量表達(dá)降低了轉(zhuǎn)基因植株對外源ABA的敏感性。另外 , 在外施 ABA合成抑制劑的情況下 , 轉(zhuǎn)基因株系的種子

5、在高鹽脅迫下的萌發(fā)受強烈抑制的表型得到恢復(fù)。 5. 對 ZmWRKY17作用機制進(jìn)行了初步探索, 通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)Ω啕}脅迫處理前后的擬南芥植株( 包括野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株)進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) , 野生型擬南芥在高鹽處理后共獲得316 個差異表達(dá)基因 , 轉(zhuǎn)基因株系中共獲得 334 個差異表達(dá)基因。通過對 RD29B、RAB18、KIN1、DREB1F、bHLH92等多個脅迫應(yīng)答功能基因的表達(dá)變化分析發(fā)現(xiàn), 在高鹽條件下 , 這些抗逆功能基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)上調(diào)變化程度顯著低于野生型植株。而 ABA合成相關(guān)基因 NCED5在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)上調(diào)變化程度顯著高于野生型植株。 綜上所述 , 本研究首先對玉米中 d 亞族 WRKY基因的分子特性進(jìn)行了分析。根據(jù)誘導(dǎo)表達(dá)模式、進(jìn)化關(guān)系和序列特征等分析結(jié)果 , 選取了 ZmWRKY17作為關(guān)鍵基因進(jìn)行下一步的功能研究。 過量表達(dá)該基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫的敏感性 , 同時 , 轉(zhuǎn)基因植株對 ABA的敏感性降低。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果證實野生型植株和轉(zhuǎn)基因株系在高鹽處理后, 一