含氯釕(ii)多吡啶配合物的合成及其生物活性研究--洪冰

1、本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))含氯釕(II)多吡啶配合物的合成及其生物活性研究二級(jí)學(xué)院藥科學(xué)院專 業(yè)藥學(xué)（日語特色）班 級(jí)2008級(jí)學(xué)生姓名洪冰學(xué) 號(hào)0803504115指導(dǎo)教師黃宏靚2012年4月誠 信 聲 明我聲明，所呈交的畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）是本人在老師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我查證，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文（設(shè)計(jì)）中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。我承諾，論文（設(shè)計(jì)）中的所有內(nèi)容均真實(shí)、可信。畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）作者（簽名）：年月日含氯釕(II)多吡啶配合物的合成及其生物活性研究【摘要】本論文研究了多吡啶金屬配

2、合物Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2的合成和它在生物活性方面的研究。對(duì)所合成的配合物進(jìn)行了表征，采用凝膠電泳研究配合物與DNA的作用，采用MTT法研究了配合物的體外細(xì)胞毒性，結(jié)果表明三個(gè)配合物能使DNA發(fā)生裂解，對(duì)體外細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性。另外，這些配合物能有效清除羥基自由基?！娟P(guān)鍵詞】釕(II)配合物；抗氧化活性；抗腫瘤Synthesis and bioactivity studies of ruthenium(II) polypyridyl complexes containing chlor

3、ide atom Abstract Three ruthenium(II) polypyridyl complexes Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2 1、Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2 2、Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2 3 were synthesized and characterized by elemental analysis, ES-MS and 1H NMR. The DNA binding behaviors were studied by photocleavage upon irradiation. The antioxidant a

4、ctivity against hydroxyl radical of the complexes were investigated. The cytotoxicity in vitro towards A549, BEL-7402, Hela and SKBR-3 were studied by MTT assay. The results show that these complexes show high cytotoxic activity.Keywords Ruthenium (II) complex Antioxidant activity Cytotoxicity in vi

5、tro目 錄1 前言12 實(shí)驗(yàn)部分52.1. 儀器與試劑.52.1.1. 儀器. 52.1.2. 試劑.62.2. 配體及配合物的制備62.2.1. 配體CPIP的合成.62.2.2. 配合物Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2的合成及純化72.3. 配合物的生物活性研究82.3.1. 抗氧化性實(shí)驗(yàn)82.3.2. 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)82.3.3. 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)83 結(jié)果與討論93.1. 配合物合成與表征93.2. 配合物的抗氧化性實(shí)驗(yàn)93.3. 配合物的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)113.4. 配合物的體外細(xì)胞毒性實(shí)

6、驗(yàn)124 結(jié)論14參考文獻(xiàn)15致謝.17附錄.18 1 前言核酸是生物體遺傳信息的載體，參與生物遺傳信息在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)并合成代謝過程所必須的蛋白質(zhì)和其它生物活性物質(zhì)，進(jìn)而控制生物體內(nèi)的各種反應(yīng)和調(diào)節(jié)體內(nèi)生理機(jī)制。由于核酸介入了生物的成長、發(fā)育和繁殖等各種生命活動(dòng)，并與致癌等病理過程密切相關(guān)。因此，研究DNA的結(jié)構(gòu)、功能及其與藥物的作用方式等，將有助于人們戰(zhàn)勝各種疾病并從分子水平上揭開生命現(xiàn)象的本質(zhì)1 。 自從20世紀(jì)60年代以來，無機(jī)化學(xué)與生物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、物理化學(xué)、分析化學(xué)、醫(yī)學(xué)臨床化學(xué)、營養(yǎng)化學(xué)、環(huán)境化學(xué)等學(xué)科相互滲透、相互融合，形成了諸如生物無機(jī)化學(xué)，金屬有機(jī)化學(xué)等具有廣闊前景的交叉學(xué)

7、科。小分子金屬配合物與DNA相互作用的研究正是生物無機(jī)化學(xué)的研究熱點(diǎn)，它從分子水平上研究DNA與無機(jī)化合物相互作用的各種方式和作用機(jī)理，分析測定這些生物化合物結(jié)構(gòu)和性能以及它們在活體中的作用的一門學(xué)科。自從1979年順鉑作為抗腫瘤藥物進(jìn)入臨床以來，金屬配合物的合成以及抗腫瘤活性研究激起了科學(xué)家們極大的興趣，但是順鉑類合成的藥物具有毒副作用十分明顯,如腎毒性、骨髓毒性、耳毒性、外周神經(jīng)毒性、催吐性及長期使用產(chǎn)生的耐藥性等等缺陷，極大地限制了這類藥物的發(fā)展。近年來研究者把目光轉(zhuǎn)向了非鉑類藥物的開發(fā)，釕配合物便是其中的佼佼者。釕是繼順鉑之后最有希望成為活性高、毒性低的金屬之一。合成和發(fā)現(xiàn)高效低毒的抗

8、癌藥物，研究其作用機(jī)理以及在分子和細(xì)胞水平上研究癌癥的起因，這項(xiàng)工作在醫(yī)學(xué)，生物學(xué)，和化學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域有著重要的理論意義。這些年來，一類新型抗癌藥金屬配合物抗癌藥的研究，日益受到廣大藥學(xué)工作者和化學(xué)工作者的重視，他們在繼續(xù)研究順鉑類藥物的同時(shí)，還在其它金屬類配合物抗癌藥等方面開展了大量的工作。近年來，小分子配合物，尤其是含氯釕(II)多吡啶配合物與生物大分子DNA相互作用的研究已經(jīng)成為生物無機(jī)化學(xué)非常活躍的研究領(lǐng)域，并取得了許多舉世矚目的成就。含氯釕(II)多吡啶配合物可用作核酸結(jié)構(gòu)的探針、核酸非放射性的發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物以及分子光開關(guān)，它可幫助我們了解DNA損傷和修復(fù)機(jī)理，對(duì)開發(fā)治療與基因

9、突變有關(guān)疾病的藥物具有指導(dǎo)作用，這使得含氯釕(II)多吡啶配合物在治療癌癥、艾滋病、某些遺傳性疾病以及抗菌消炎方面具有潛在的應(yīng)用前景。金屬配合物與核酸相互作用的研究之所以引起無數(shù)科研工作者極大的研究熱情，是因?yàn)榻饘倥浜衔锊粌H可以作為DNA結(jié)構(gòu)探針，DNA足跡試劑，特定DNA系列的斷裂劑，還可作為潛在的抗癌藥物2-5。自從人類認(rèn)識(shí)到DNA是細(xì)胞活動(dòng)和功能的操控者6以來，大量的研究集中在小分子物質(zhì)與DNA相互作用這一領(lǐng)域。而釕(II)配合物能夠吸引如此眾多研究者的注意不僅要?dú)w因于它們能與DNA特定的位置結(jié)合，還考慮到這類化合物能夠作為抗癌藥物7-13。事實(shí)上，很多抗癌、抗瘧疾、抗病毒藥物的藥理活性

10、都與藥物和DNA的作用有關(guān)14，因而很多研究者將注意力集中到DNA結(jié)合作用的機(jī)制上來。研究表明，釕(II)配合物能通過共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵(包括靜電結(jié)合、溝槽結(jié)合、插入作用)與DNA發(fā)生作用。近年來，釕(II)配合物作為抗腫瘤藥物的研究被廣泛報(bào)道8,10，研究中發(fā)現(xiàn)一些釕(II)多吡啶配合物對(duì)某些特定的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。釕(II)多吡啶配合物在合成方面研究較早，一開始主要是為了研究相應(yīng)的光化學(xué)、光物理、電化學(xué)等方面的性質(zhì)，但是，到了90年代中期，有報(bào)道化合物mer-Ru(terpy)C13(terpy為2,2,6,2-三聯(lián)吡啶)對(duì)LS/BL鼠腹水癌表現(xiàn)出活性15。更令人欣喜的是，從9

11、0年代末期大量的多吡啶類配合物被合成，常見的如Ru(bpy)2(L)2+(L = IP, PIP, HPIP, DPPZ等)(見圖1化合物7,8,9,10)，并且對(duì)這類化合物進(jìn)行了BEL-7402肝癌、HL-60白血病、KB鼻咽癌、HeLa宮頸癌等瘤株的體外活性篩選，結(jié)果都表現(xiàn)出不同程度的活性，有的甚至與順鉑相當(dāng)16。中山大學(xué)計(jì)亮年研究小組對(duì)多吡啶類化合物的研究甚為全面，從九十年代中期就開始致力于釕多吡啶配合物的設(shè)計(jì)、合成及其生物活性研究17。他們系統(tǒng)的合成了數(shù)百個(gè)釕配合物，并對(duì)其進(jìn)行了廣泛的體外活性篩選。有研究者把多吡啶釕配合物與卟啉化合物鍵合，得到了釕的卟啉配合物，如Ru(bpy)2(MP

12、yTPP)Cl， MpyTP, P = 四苯基卟啉18 Ru(bpy)2(Mpy3M4HPP)Cl,Mpy3M4HPP = 3-甲氧基-4-羥基四苯基卟啉19(見圖1化合物11,12)。由于卟啉及其金屬衍生物對(duì)腫瘤組織具有特殊的親和力，能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)靶向進(jìn)攻；并且由于卟啉環(huán)具有強(qiáng)的親脂性，能夠提高釕配合物的脂水分配系數(shù)，增強(qiáng)其透過細(xì)胞膜的能力。圖1 多吡啶釕配合物的分子結(jié)構(gòu)金屬配合物與DNA有多種結(jié)合方式，其中共價(jià)結(jié)合是較強(qiáng)的方式。鉑系配合物大都是通過這種方式與DNA分子交聯(lián)，從而干擾DNA的生理功能，達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。但是也有些金屬配合物如釕配合物與DNA是非共價(jià)結(jié)合，包括插入作用

13、、溝面結(jié)合和靜電作用等模式,研究表明這些配合物能夠以插入、靜電和溝面結(jié)合三種方式與DNA作用,其中插入模式最為重要,因?yàn)榕浜衔锏暮芏嘈再|(zhì)都與插入結(jié)合有關(guān)20。本文中提到三個(gè)新合成的含氯釕(II)多吡啶配合物：Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2，其結(jié)構(gòu)分別如下圖2a、圖2b、圖2c。 。 圖2a Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2 圖2b Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2 圖2c Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2 2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器和試劑2.1.1 儀器 名稱 型

14、號(hào) 廠家 萬分之一電子天平 CP3245 德國Sartorious 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 ZQF-85A 上海醫(yī)械專機(jī)廠 循環(huán)水式多用真空泵 SHZ-D(III) 天津華鑫儀器廠 恒溫水浴鍋 B220 上海雅榮化工設(shè)備儀器有限公司 恒溫磁力加熱攪拌器 85-2 金壇市宏華儀器廠 電子節(jié)能控溫儀 0607051 河南豫華儀器有限公司 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 GZX-9140MBE 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療 氮?dú)鉁p壓器 YQD-6 上海減壓器廠 紫外分光光度計(jì) UV-2500PC 島津Series2.1.2 試劑 試劑 規(guī)格 廠家乙腈 分析純 天津市科盟化工工貿(mào)有限公司甲苯 化學(xué)純 天津市富宇精細(xì)化工有限公司乙

15、醇 分析純 廣州化學(xué)試劑廠中性氧化鋁 100200目 上海試劑廠 DNA 上海生工氨水 分析純 廣州化學(xué)試劑廠乙醚 分析純 廣州化學(xué)試劑廠冰乙酸 化學(xué)純 汕頭光華化學(xué)廠乙酸銨 分析純 阿拉丁試劑有限公司對(duì)氯苯甲醛 分析純 阿拉丁試劑有限公司高氯酸鈉 分析純 上海潤捷化學(xué)試劑廠2.2 配體及配合物的制備2.2.1 配體CPIP的合成2.2.1.1鄰菲咯啉-5,6-二酮合成路線將2.0 g鄰菲咯啉和2.0 溴化鉀拌勻置于圓底燒瓶中然后滴加冷的濃H2SO4 (20 mL)和濃HNO3 (20 mL)的混和酸，滴加完畢后維持溫度在80-85 oC反應(yīng)3小時(shí)，冰水冷卻，將反應(yīng)液移到燒杯，加入適量的NaO

16、H溶液中核至pH = 7左右。用360 ml氯仿萃取，合并有機(jī)相后，用30 mL水洗滌，最后用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾后減壓蒸去氯仿，得到橙黃色的粗品。粗產(chǎn)品用乙醇溶解后，重結(jié)晶得到黃色針狀晶體，產(chǎn)率為75%。2.2.1.2 配體CPIP的合成往三口圓底燒瓶中加入鄰菲咯啉-5,6-二酮0.3173g、對(duì)氯苯甲醛0.2155g、乙酸銨0.3130g以及冰醋酸20ml，通入Ar，130恒溫回流反應(yīng)2小時(shí)，待冷卻后加入氨水中和，然后將反應(yīng)液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再真空干燥即得配體CPIP。 ES-MS (CH3CN): m/z = 331.3 M + 12.2.2 配合物Ru(bpy)2(CPIP)(C

17、lO4)2、Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2的合成及純化2.2.2.1 配合物Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2的合成稱取Ru(bpy)2Cl2 0.26 g (0.5mmol), CPIP 0.165 g (0.5 mmol)，加入乙醇30 mL，通入Ar，95 oC恒溫回流反應(yīng)8小時(shí)，然后將反應(yīng)液濃縮至約10 mL，倒入燒杯，加2勺高氯酸鈉以及蒸餾水300 mL，此時(shí)有沉淀析出，待沉淀析出完全后抽濾，將沉淀真空干燥即可分別得到配合物。將此配合物用少量乙腈溶解，中性氧化鋁過柱，收集紅色組分。1H NMR (DMSO-d6): 9

18、.06 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 8.85 (dd, 4H, J = 8.5, J = 8.5 Hz), 8.33 (d, 2H, J = 5.0 Hz), 8.20 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 8.08 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 8.01 (d, 2H, J = 5.0 Hz), 7.89 (dd, 2H, J = 5.0, J = 5.5 Hz), 7.85 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.68 (d, 2H, J = 6.5 Hz), 7.58-7.61 (m, 4H), 7.36 (t, 2H, J = 5.0 Hz). ES

19、-MS (CH3CN): m/z 742.4 (M-2ClO4-H+), 371.5 (M-2ClO42+). 2.2.2.2 配合物Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2的合成Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2的合成和提純同上。1H NMR (DMSO-d6): 9.05 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 8.77 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 8.39 (s, 4H), 8.34 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 8.12 (d, 4H, J = 6.0 Hz), 8.07 (d, 2H, J = 5.0 Hz), 7.99 (d, 2H, J

20、= 6.5 Hz), 7.71-7.81 (m, 6H). ES-MS (CH3CN): m/z 790.3 (M-2ClO4-H+), 395.5 (M-2ClO42+). 2.2.2.3 配合物Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2的合成Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2的合成和提純同上。1H NMR (DMSO-d6): 9.02 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 8.38 (d, 2H, J = 6.0 Hz), 8.27 (s, 4H), 8.21 (d, 2H, J = 5.5 Hz), 7.98 (d, 2H, J = 5.5 Hz), 7.82 (d, 2H

21、, J = 5.5 Hz), 7.78 (d, 2H, J = 5.5 Hz), 7.62-7.76 (m, 20H), 7.60 (d, 2H, J = 6.5 Hz). ES-MS (CH3CN): m/z 1094.3 (M-2ClO4-H+), 547.4 (M-2ClO42+). 2.3 配合物的生物活性研究2.3.1 抗氧化性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)依據(jù)Fenton體系21，產(chǎn)生羥基自由基，研究化合物清除羥基自由基的效果，進(jìn)而推測化合物的抗氧化活性。首先，配制磷酸鹽緩沖液（Tris IV），稱取磷酸二氫鈉0.5226 g，磷酸氫二鈉1.1998 g，用磷酸調(diào)pH至7.4，加水定容配成到500

22、mL，即得。然后將配合物用乙腈溶解，配置成100 M的溶液。實(shí)驗(yàn)測試的4 mL溶液由四部分組成：番紅精(0.5mM)1 mL、雙氧水（3%）1 mL、EDTA-Fe(II) (2.5 M)1 mL、所測試的配合物(100 M)和磷酸鹽緩沖液（Tris IV）共1mL。測試溶液在37 oC水浴中反應(yīng)30 min，然后在520 nm波長下測試吸光度值三次，求平均值。計(jì)算配合物對(duì)羥基自由基的清除率C而得知化合物的抗氧化能力的大小，按照公式1-1計(jì)算清除率：C = (1-1)式中，Ai是測試的配合物存在時(shí)的吸光度值；Ac是配合物，EDTA-Fe(II)和雙氧水不存在時(shí)的吸光度值、A0是配合物不存在時(shí)的

23、吸光度值。2.3.2 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)配好電泳液，做好凝膠板，把不同濃度的的配合物加入DNA，使反應(yīng)液的體積保持在10 L，在365 nm光源下照射45 min，然后加入2 L溴酚藍(lán)，混合一起加入到凝膠板的各個(gè)小孔里。在90 V, 75 mA下電泳100 min，再在溴化乙錠下著色10 min，用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。2.3.3 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-3,5-二苯基四氮唑溴鹽)法研究了化合物的體外細(xì)胞毒性22。實(shí)驗(yàn)時(shí)，往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.1 mL含2104靶細(xì)胞的培養(yǎng)液，于37 oC，5CO2的飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。然后加入化合物，使溶液中所測

24、試化合物的濃度達(dá)到10-6到10-4M，對(duì)照組的細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0.1ml培養(yǎng)基，將測試組和對(duì)照組置于37 oC，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次。每孔加20 L 5mg/mL的MTT染料溶液，在同樣條件下培養(yǎng)4 h后，加入0.1ml含有50%DMF的緩沖液和20%的十二烷基磺酸鈉溶液，用以溶解細(xì)胞中形成的甲瓚。用酶標(biāo)儀在490納米處檢測各孔OD值，每孔測試3次，求平均值。實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞有肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、子宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞。3 結(jié)果與討論3.1 配合物合成及表征實(shí)驗(yàn)合成的配合物是Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(bpy)2(CPIP)

25、(ClO4)2、Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2，均為紅色晶體。將合成的配合物進(jìn)行了質(zhì)譜分析，從圖譜中看出配合物都出現(xiàn)了分子離子峰。其次質(zhì)譜以及核磁共振氫譜對(duì)配合物的表征結(jié)果顯示，所合成的化合物與目標(biāo)配合物的結(jié)構(gòu)一致。3.2 配合物的抗氧化性實(shí)驗(yàn)?zāi)芤l(fā)氧化還原反應(yīng)的自由基如羥基自由基、雙氧自由基會(huì)引起人體細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷。這種損傷會(huì)導(dǎo)致人的衰老和包括腫瘤，慢性炎癥的等疾病。所有的這些自由基當(dāng)中，羥基自由基被認(rèn)為是破壞性最強(qiáng)的一種。因此，消除這種自由基是抗氧化性實(shí)驗(yàn)的主要目標(biāo)。我們依據(jù)化合物消除由Feton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基能力的大小考察了這些化合物的抗氧化性能力。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1a

26、、 表1b、表1c所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：表1 Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2抗氧化性數(shù)據(jù)phencpipconcentration（M）absorbanceAc-Ao清除率Ao0.01Ac0.4310.421 A12.50.0360.062 6.2%A23.750.0770.159 15.9%A35.00.1030.221 22.1%A46.250.1680.375 37.5%A57.50.2230.506 50.6%A68.750.2630.601 60.1%A7100.3220.741 74.1%表2 Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2抗氧化性數(shù)據(jù)bpycpipc

27、oncentration（M）absorbanceAc-Ao清除率Ao0.011Ac0.430.419 A10.250.0210.024 2.40%A20.750.0970.205 20.50%A31.250.160.356 35.60%A41.750.1960.442 44.20%A5A62.252.750.240.2720.547 0.623 54.70%62.30%A73.250.3120.718 71.80%表3 Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2抗氧化性數(shù)據(jù)dipcpipconcentration（M）absorbanceAc-Ao清除率Ao0.01Ac0.4280.418

28、A11.250.0230.031 3.10%A220.0480.091 9.10%A32.750.0750.156 15.60%A43.50.110.239 23.90%A54.250.1740.392 39.20%A650.2980.689 68.90%A75.750.3270.758 75.80% 圖3 配合物的抗氧化活性圖由結(jié)果圖3可以看出，Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2和Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2抗氧化性能力，而且隨著配合物濃度的增大，抗氧化性能力越來越強(qiáng)。3.3 配合物的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)用于幫助了

29、解小分子金屬配合物與DNA作用機(jī)理，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)Ru(II,III)、Co(II)、Cu(II)等金屬配合物斷裂DNA。當(dāng)配合物以溝面或靜電作用與DNA結(jié)合時(shí)，一般不會(huì)引起DNA超螺旋的解旋。對(duì)于以插入模式與DNA結(jié)合的配合物，它們與雙螺旋DNA具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，并且含有一個(gè)具有氧化還原活性的中心金屬離子。這些配合物對(duì)氧化劑相對(duì)比較穩(wěn)定，而對(duì)光則比較敏感，因此可以利用光輻射使這些配合物成為光裂解試劑，產(chǎn)生單線態(tài)氧，或者脫去氫原子生成自由基，而使DNA裂解。而DNA分子在高于其等電點(diǎn)的pH緩沖液中帶負(fù)電荷，在電場作用下將向正極移動(dòng)。在凝膠中具有不同分子量的DNA的遷移率是不同的，分子

30、量越小，遷移率越大。而對(duì)于不同構(gòu)型的DNA，即使分子量相同，DNA在電泳中的遷移率也會(huì)明顯不同。如質(zhì)粒DNA中存在的三種構(gòu)型。其中共價(jià)閉環(huán)的超螺旋Form I的結(jié)構(gòu)最為緊密，遷移率最大，走在最前面。線形的Form III走在其次。而開環(huán)缺刻的Form II由于結(jié)構(gòu)比較松散，走在最后面。當(dāng)配合物以插入模式與超螺旋質(zhì)粒DNA作用后，如果能引起DNA閉環(huán)超螺旋的解旋，閉環(huán)Form I就變成開環(huán)缺刻的Form II構(gòu)型，使得DNA在凝膠中的遷移率減小，直到超螺旋消失。當(dāng)超螺旋DNA上的一條鏈上出現(xiàn)一個(gè)缺刻時(shí)，超螺旋結(jié)構(gòu)就被松開，形成開環(huán)缺刻型結(jié)構(gòu)。而當(dāng)兩條鏈在同一位置被斷裂時(shí)，就變成線形結(jié)構(gòu)。通過觀察

31、pBR322 DNA的三種構(gòu)型之間的轉(zhuǎn)化，就可以判斷配合物對(duì)DNA的斷裂情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。圖4 配合物與DNA的凝膠電泳圖由圖4可以看出，在365 nm光照45 min的條件下，Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2和Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2能使DNA發(fā)生有效斷裂，而且隨著配合物濃度的增大，斷裂效果越來越明顯。3.4 配合物的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)我們采用MTT比色法測試了化合物對(duì)抗肺癌細(xì)胞（A-549）、肝癌細(xì)胞（BEL-7402）、子宮頸癌細(xì)胞（HeLa）、乳腺癌細(xì)胞（SKBR-3）增殖的活性。MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存

32、活和生長的方法。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。其檢測原理是：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值。由于在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，因此該方法可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。配合物對(duì)4種體外細(xì)胞（A-549、BEL-7402、HeLa、SKBR-3）毒性實(shí)驗(yàn)的IC50數(shù)據(jù)見表2，其結(jié)果分別為圖5a、圖5b、圖5c、圖5d：表2

33、 配合物的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) CompoundIC50( M)A549Bel-7402HelaSKBR-3bpycpip25.620.326.227.5phencpip49.617.545.656.3dipcpip21.524.716.718.4圖5 配合物的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖從圖5中可以看出50%細(xì)胞存活時(shí)各個(gè)配合物的濃度(IC50)，其中配合物Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)2的IC50值都比較小。4 結(jié)論綜合論文內(nèi)容，我通過實(shí)驗(yàn)合成得到了釕配合物Ru(phen)2(CPIP)(ClO4)2、Ru(bpy)2(CPIP)(ClO4)2和Ru(dip)2(CPIP)(ClO4)

34、2，采用質(zhì)譜和核磁共振波譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了表征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論計(jì)算值基本一致；采用瓊脂糖凝膠電泳研究三個(gè)配合物與DNA的作用，結(jié)果表明三個(gè)配合物在一定條件下能夠使DNA發(fā)生裂解，通過MTT方法研究表明配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，抗氧化性實(shí)驗(yàn)表明配合物能有效清除羥基自由基。參考文獻(xiàn)1 曾承輝釕(II)多吡啶配合物的合成、DNA作用及抗腫瘤、抗氧化活性研究 D廣州：廣東藥學(xué)院，2010.2 K. E. Erkkila,D. T. Odem, J. K. Barton, Chem. Rev. 1999, 99: 27772796.3 Y. J. Liu, C.H. Zeng, Z. H.

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