醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗工作導則

1、附件醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則 一、臨床基因擴增檢驗實驗室的設計（一）臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設計原則。原則上臨床基因擴增檢驗實驗室應當設置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。這4個區(qū)域在物理空間上必須是完全相互獨立的，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應當始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當合并。例如使用實時熒光PCR儀，擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并；采用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。各區(qū)的功能是：1.試劑儲存和準備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和

2、擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。2.標本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作，應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規(guī)范的要求。3.擴增區(qū)：cDNA合成、DNA擴增及檢測。4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)：擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。（二）臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向。臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向可按照試劑儲存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)進行，防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域?？砂凑諒脑噭﹥Υ婧蜏蕚鋮^(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力遞減的方式進行。

3、可通過安裝排風扇、負壓排風裝置或其他可行的方式實現(xiàn)。（三）工作區(qū)域儀器設備配置標準。1.試劑儲存和準備區(qū)。（1）28和-20以下冰箱。（2）混勻器。（3）微量加樣器（覆蓋0.2-1000l）。（4）可移動紫外燈（近工作臺面）。（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭。（6）專用工作服和工作鞋(套)。（7）專用辦公用品。2.標本制備區(qū)。（1）2-8冰箱、-20或-80冰箱。（2）高速離心機。（3）混勻器。（4）水浴箱或加熱模塊。（5）微量加樣器（覆蓋0.2-1000l）。（6）可移動紫外燈（近工作臺面） 。（7）生物安全柜。（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭

4、（帶濾芯）。（9）專用工作服和工作鞋(套)。（10）專用辦公用品。（11）如需處理大分子DNA，應當具有超聲波水浴儀。3.擴增區(qū)。（1）核酸擴增儀。（2）微量加樣器（覆蓋0.2-1000l），（視情況定）。（3）可移動紫外燈（近工作臺面）。（4）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）。（5）專用工作服和工作鞋。（6）專用辦公用品。4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)。視檢驗方法不同而定，基本配置如下：（1）微量加樣器（覆蓋0.2-1000l）。（2）可移動紫外燈（近工作臺面）。（3）消耗品：一次性手套、加樣器吸頭（帶濾芯）。（4）專用工作服和工作鞋。（5）專用辦公用品。上述各區(qū)域儀器設備配

5、備為基本配備，實驗室應當根據(jù)自己使用的擴增檢測技術或試劑的特點，對儀器設備進行必要的增減。二、臨床基因擴增檢驗實驗室工作基本原則(一)進入各工作區(qū)域應當嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū) 擴增產(chǎn)物分析區(qū)。(二)各工作區(qū)域必須有明確的標記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品不得混用。(三)不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。(四)實驗室的清潔應當按試劑貯存和準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。(五)工作結束后，必須立即對工作區(qū)進行清潔。工作區(qū)的實驗臺表面應當可耐

6、受諸如次氯酸鈉的化學物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應當方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關鍵，因此可使用可移動紫外燈（254nm波長），在工作完成后調(diào)至實驗臺上6090cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對（bp），對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。(六)實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序，所有操作符合實驗室生物安全通用要求（GB19489-2008）。三、臨床基因擴增檢驗實驗室各區(qū)域工作注意事項(一)試劑儲存和準備區(qū)。貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應當直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過擴增檢測區(qū)，試劑盒中的陽

7、性對照品及質(zhì)控品不應當保存在該區(qū)，應當保存在標本處理區(qū)。 (二)標本制備區(qū)。由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，可通過在本區(qū)內(nèi)設立正壓條件，避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。(三)擴增區(qū)。為避免氣溶膠所致的污染，應當盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。必須注意的是，所有經(jīng)過檢測的反應管不得在此區(qū)域打開。(四)擴增產(chǎn)物分析區(qū)。核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法（放射性核素標記或非放射性核素標記）、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法、質(zhì)譜分析等。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1 mol/L HCl中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而