番茄紅素吸收與體內(nèi)抗氧化的機(jī)理研究

1、番茄紅素吸收與體內(nèi)抗氧化的機(jī)理研究營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生食品科學(xué)2007,vol28,no.11545番茄紅素吸收與體內(nèi)抗氧化的機(jī)理研究范遠(yuǎn)景,黃璐(合肥工業(yè)火學(xué)牛物與食品工程學(xué)院,安徽合肥230069)摘要:番茄紅素是有效的生物抗氧化劑,近年來(lái)人們對(duì)番茄紅素進(jìn)行了大量的研究,發(fā)現(xiàn)番茄紅素具有多種生物學(xué)功能,如淬滅單線態(tài)氧,清除自由基,誘導(dǎo)細(xì)胞通訊和細(xì)胞信號(hào),抑制腫瘤等.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了番茄紅素(1ycopene,lp)對(duì)小鼠抗氧化酶體系影響的研究.小鼠飼喂番茄紅素4d后取血,測(cè)定血清和肝勻漿的超氧化物歧化酶(sod),過(guò)氧化氫酶(cat),過(guò)氧化物酶(pod)活性,丙二醛(mda)的含量.各番茄紅素給藥組的小

2、鼠血清和肝組織的sod,cat和pod活性上升,mda含量降低.與空白組比較,結(jié)果有顯著性差異.番茄紅素的體內(nèi)抗氧化與內(nèi)源性抗氧化酶體系的活性激活有關(guān).關(guān)鍵詞:番茄紅素;吸收;小鼠;抗氧化studyonmechanismoflycopeneabsorptionandantioxidafioneffectsonmiceinvivofanyuan-jing,huanglu(instituteofbiologicalandfoodindustry,hefeiuniversityoftechnology,hefei230069,china)abstract:ithasbeensuggestedthat

3、lycopenehasmanybiologicalfunctions,suchasquenchingsingletoxygenandeliminatingfleeradical,promotioncellcommunicationandsignalcellsandinhibitingcellularmalignanttransformation.sincethesubjectoflycopenebioefficacyandbioavailabilityhasnotbeenstudiedthoroughlyyet,thisexperimentcarriedoutthestudyonlycopen

4、eaffectionwithantioxidativeenzymes,suchassuperoxidedismutase(sod),catalase(cat)andperoxidase(pod)frommiceliver.lycopenewasfirstlyextractedfromtomatoesbypetroleumether.thegroupof6micewasfed1weekwiththelycopenethenkilledforassay.theactivitiesofsod,pod,catandthecontentofmalondiadehyde(mda)weredetermine

5、drespective.duetolycopenetreatment,theactivitiesofsod,podincrease,whilethecontentofmdadecreases.comparedtocontrolgroup,theresultsshowedthatlycopenecanenhancemicesantioxidativecapabilityandinhibittheirlipidperoxidation.keywords:lycopene;absorption;mice;antioxidative中圖分類號(hào):$571.1;ts272.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:a文章編號(hào):100

6、26630(2007)11-054504很多研究結(jié)果都證實(shí)了番茄紅素具有抗氧化,清除自由基的生物學(xué)效應(yīng).但是番茄紅素的體內(nèi)吸收和生物利用上存在一些不明確的問(wèn)題.對(duì)人體而言,很多因素影響番茄紅素的吸收.有人將番茄紅素吸收口丁分為4步:食物基質(zhì)的消化,形成固定的磷脂微團(tuán),被小腸粘膜細(xì)胞攝取以及經(jīng)淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn).每一步脂肪都是必需的.l夭j此,食物基質(zhì)的組成,顆粒大小,加工處理和人體脂肪代謝狀況等因素都可能會(huì)影響到番茄紅素的吸收.吸收后進(jìn)入體內(nèi)的番茄紅素所顯示的淬滅氧自由基和上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶類活性效應(yīng)成為番茄紅素生物學(xué)效應(yīng)研究的重點(diǎn)內(nèi)容.在生物體內(nèi)由于番茄紅素的生物學(xué)性質(zhì)2,伴隨著消除氧自由基的發(fā)生

7、,產(chǎn)生著一系列生理生化反應(yīng)過(guò)程,了解和研究這些過(guò)程機(jī)理有助于促進(jìn)番茄紅素在預(yù)防疾病應(yīng)用方面的深入研究.本研究進(jìn)行番茄紅素的不同溶劑液灌胃小鼠實(shí)驗(yàn),比較小鼠血液番茄紅素的含量濃度和體內(nèi)抗氧化效果,探討提高番茄紅素的生物學(xué)效應(yīng)和生物利用度的機(jī)理過(guò)程.1材料與方法1.1材料番茄市售;菜子油市售.1.2試劑丙酮,乙醚,乙酸乙酯,氯仿,氫氧化鈉,鹽酸,石油醚.1.3番茄紅素的提取方法提取工藝流程如下所示:番茄一搗碎成泥一有機(jī)溶劑浸提一提取液一番茄紅素.石油醚與丙酮以1:2的比例混合作為提取液,浸提6h,再將混合物過(guò)濾,蒸餾收稿日期:20060909作者簡(jiǎn)介:范遠(yuǎn)景(1958-),男,副教授,博士,主要從

8、事食品營(yíng)養(yǎng)與安全方面研究.5462007,vo1.28,no.11艮品科學(xué)營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生干燥,除去有機(jī)溶液,制得番茄紅素粗提粉狀物.按照3mg/ml濃度調(diào)制制成水乳濁液和油溶液的灌胃液.番茄紅素溶液在475nm比色計(jì)算含量.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用18只購(gòu)白安徽科人學(xué)純種雌性健康小鼠,隨機(jī)分為3組,每組6只,實(shí)驗(yàn)灌胃不同溶劑的番茄紅素灌喂劑后的血液番茄紅素濃度;54只同樣小鼠隨機(jī)分為3組,每組6只,測(cè)定油溶番紅素灌喂劑后的血漿sod,cat和pod酶活性;18只同樣小鼠隨機(jī)分為3組,每組6只,測(cè)定油溶番茄紅素灌喂劑后的血漿mda含量.1.5番茄紅素吸收與抗氧化實(shí)驗(yàn)1.5.1吸收實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組,每組6

9、只,分別為空白對(duì)照組,水溶番茄紅素組,油溶番茄紅素組,空白組喂食普通例料,番茄紅素灌肖量按照30mg/kg?bw,胃底灌肖,連續(xù)4d,每天兩次.第4d?！静肺故晨崭惯^(guò)夜后,次日早晨小鼠眼球取血,置于預(yù)先用月f素鈉110u/l的溶液處理過(guò)的離心管.迅速放入高速離心機(jī)中,5000r/min離心5rain后用微量進(jìn)樣器小心吸取上清液,用石油醚:丙酮=1:2的混合液定量浸提上清液,在475nm比色.1.5.2抗氧化實(shí)驗(yàn)取3組小鼠,分別為即空白對(duì)照組,水溶番茄紅素組和油溶番茄紅素組,喂食方法同上,連續(xù)4d,每天兩次.第4d停止喂食空腹過(guò)夜后,取小鼠月臟制酶液.酶液制備:取肝臟,加9倍肝臟質(zhì)量的預(yù)冷pbs

10、溶液,冰水浴中勻漿,15000r/min,離心15min(離心時(shí)溫度維持在4),上清液即為酶的提取液,置冰箱保存?zhèn)溆?1.5_3酶活性的測(cè)定f3_樣液蛋白量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法(g一250)定蛋白質(zhì)濃度.bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天試劑公司),包括:g250染色液(4保存),蛋白標(biāo)準(zhǔn)(bsa)5mg/ml(一20c保存),pbs已配準(zhǔn)各稀釋用.按試劑盒說(shuō)明,酶標(biāo)儀在578nm的波長(zhǎng)下測(cè)定(318mc型酶標(biāo)儀上?？乒?比色法分別檢測(cè)肝臟酶液樣蛋白量.sod酶活性的測(cè)定3ml反應(yīng)液中,磷酸緩沖液(ph7.0)的濃度為50mmol/l,甲硫氨酸的濃度為13mm

11、ol/l,氮藍(lán)四唑(nbt)的濃度為75mmol/l,edta的濃度為0.1mmol/l,核黃素的濃度為4umol/l,酶液200ul搖勻后快速置于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng),結(jié)束時(shí)立即置于黑暗處終止反應(yīng),并在560nm下比色,1個(gè)酶活性單位相當(dāng)于引起3ml反應(yīng)液達(dá)到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5o%抑制所需要的酶量,傘值的測(cè)定方法,3ml反應(yīng)液置室溫下讓酶充分失活,然后比色所測(cè)值即為全值,以as變化百分率表示酶的活性【4】.1.5.3_3cat酶活性的測(cè)定3ml反應(yīng)液中,磷酸緩沖液(ph7.0)的濃度為50mmol/l,hz0z的濃度為8mmol/l,酶液2001,30c下反應(yīng)1min,立即加入2ml體積分?jǐn)?shù)為

12、10%的hzso終止反應(yīng),然后用2mmol/lkmno溶液滴定剩余hz0z,根據(jù)hz0z的消耗量計(jì)算cat活性i5l.pod酶活性的測(cè)定3ml反應(yīng)液中,磷酸緩沖液(ph7.0)濃度為100mmol/l,愈創(chuàng)木酚濃度為30mmol/l,hzoz濃度為26mmol/l,酶液2001.在470下比色,持續(xù)50min,記錄初值和每反應(yīng)1min時(shí)的比色值,以a,表示酶的活性4_.上述三種酶活性是分別在灌喂水混合番茄紅素和油混合番茄紅素后的肝臟酶活性表示,如果需要相對(duì)比較,則用肝臟樣液蛋白量的相對(duì)酶比活力,即每毫克蛋白量中酶的活性.丙二醛(malondialdehyde,mda

13、)測(cè)定硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituricacidreactivesubstance,tbars)測(cè)定方法,上述反終止后每支試管各加入0.7%的tba水溶液3ml,沸水浴中加熱1h,冰浴冷卻后,535nm波長(zhǎng)比色.2結(jié)果與分析2.1番茄紅索吸收番茄紅素的浸提可用氯仿,乙醚,石油醚,正己烷,丙酮,乙醇以及四氫呋哺等有機(jī)溶劑.通過(guò)幾種有機(jī)試劑浸提比色分析對(duì)比,浸提效果比較好的溶劑為乙醚,丙酮,氯仿,石油醚等,但是從實(shí)際應(yīng)用推廣價(jià)值分析,采用石油醚與丙酮1:2體積混合的浸提以及吸光度比色分析效果為好,可以較好地消除p一胡蘿卜素吸光峰的干擾和影響_6i.小鼠血漿經(jīng)離心分離,上清液用石油醚j

14、丙酮混合液浸提后的紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(uv757crt)掃描圖譜(圖1),在475500nm獲得吸收峰及白血清定量添加番茄紅素的同歸曲線(圖2),并用此法檢測(cè)血液中番茄紅素含量.不同小鼠個(gè)體問(wèn)產(chǎn)生的番茄紅素吸收差異較為明顯;油溶和水溶的番茄紅素灌胃劑產(chǎn)生的血液中含量差異達(dá)到極顯著水平(見(jiàn)表11.2_2肝臟酶活性及相對(duì)比活性小鼠肝臟的sod和pod活性以測(cè)定吸光度變化率表示酶的活性,cat則以hz0z的消耗量表示其酶活性,mda以吸光度的變化率表示其相對(duì)含量變化;用肝臟勻漿酶測(cè)試的樣液進(jìn)行蛋白量測(cè)定,可以獲得酶的相對(duì)比營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生食品科孛2007,vo1.28,no.11547波k(nm)圖1血清

15、番茄紅素紫外一可見(jiàn)光掃描圖譜fig.1peakofiycopenebyuv-spectrophotometer00.050.1015番茄紅索濃度0jg/m1)圖2番茄紅素濃度含量與吸光度f(wàn)ig.2concentrationsoflycopeneandabsorbance活力,用以sod,pod和cat酶活的相對(duì)比較.根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(0.5mg/m1)配制成0.0025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5等蛋白含量濃度(mg/m1),分別在酶標(biāo)儀(578nm)上測(cè)定吸光度,得回歸曲線為y:0.9867x+0.0132(r=0.9989),水溶和油溶番茄紅素飼喂的兩組小

16、鼠肝臟勻漿酶液各取三份,分別測(cè)定吸光度,并根據(jù)回歸曲線方程計(jì)算蛋白量(表2).2_3體內(nèi)的抗氧化酶類活性在肝臟中抗氧化酶主要是谷胱甘肽過(guò)氧化酶(含硒和不含硒谷胱甘肽過(guò)氧化酶,簡(jiǎn)稱segpx和nonsegpx),cat,sod,pod等.h.0.是肝臟細(xì)胞中主要的內(nèi)源性過(guò)氧化物,其含量與內(nèi)源性氧化酶體系活性有密切關(guān)系.此實(shí)驗(yàn)選擇sod,pod和cat為番茄紅素的影響對(duì)象進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)比.小鼠肝臟經(jīng)高速離心分離后的上清液,分別按照上述酶活測(cè)定方法進(jìn)行,每份樣液用量為200ul,檢測(cè)與計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3.通常情況下,各種酶活的變化趨勢(shì)與比活基本相似,因此以(檢測(cè)值一ck)(檢測(cè)值樣液蛋白量檢測(cè)樣品用量)

17、關(guān)系計(jì)算出相對(duì)酶比活,用以比較酶活變化動(dòng)態(tài).2.4抗氧化酶活性效果從實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)入至灌胃宰殺前給與正常喂食,體重變化為購(gòu)入時(shí)20.251.03g,宰殺前27.231.04g,屬于生長(zhǎng)發(fā)育狀況正常.在正常生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)下的體內(nèi)抗氧化酶活性以及受番茄紅素的影響變化,則可以認(rèn)為主要是食物代和體內(nèi)正常生理活動(dòng)所產(chǎn)生.如表3所示,與空白對(duì)照相比,s0d,pod及cat的活性在水溶和油溶的飼喂后都有提高,但以油溶番茄紅素飼喂后抗氧化酶活性提高顯著,而伴隨的結(jié)果是體內(nèi)生物氧化產(chǎn)物丙二醛含量隨之降低(表3),脂質(zhì)過(guò)氧化作為發(fā)病機(jī)制的研究越來(lái)越受到人們的霞視.此,血清mda是一項(xiàng)有臨床意義的生物標(biāo)志物l7l.3討論

18、與結(jié)論本實(shí)驗(yàn)旨存探討番茄紅素在動(dòng)物體內(nèi)消化吸收以及對(duì)體內(nèi)吸收后的抗氧化效果,也就是番茄紅素的生物學(xué)效應(yīng)(bioefficacy)$w生物利用度(bioavailability).番茄紅素與含氧類胡蘿卜素,羥基類胡蘿卜素構(gòu)成類胡蘿卜素的三大類組成,小腸對(duì)類胡蘿卜素的吸收率很低,約占膳食量的10%30%,隨著膳食巾類胡蘿卜索的增加和脂肪減少,其吸收率下降.表1所示結(jié)果顯示,膳食條件對(duì)番茄紅素的吸收影響較大,油脂有助于番茄紅素的吸收.但是過(guò)分依賴于油溶或借助于脂肪代謝而提高番茄紅素的吸收,可能會(huì)產(chǎn)生膳食均衡的問(wèn)題.如何在滿足膳食均衡前提下提高番茄紅素的生物利用度,表1不同溶劑灌胃小鼠的血液番茄紅素濃

19、度g/m1)table1lycopeneconcentrationsinmiceplasmafedlycopenedissolutioninwaterandinoilrespectivelyg/m1)注:與水溶番茄紅素灌胃劑比較,p<0.01.表2g.250法測(cè)定樣液蛋白量table2testsforproteinconcentrationsofsamplefrommouseliverbyg?250a578nm磊溶番茄釘素飼喂小鼠肝臟勻漿10.17601860.1790.18130.1720.188s樣液蛋白量(mg/m1)0.17570.00351.64690.18500.003617

20、412oooooooogn5482007,vo1.28,no.11艮晶科學(xué)營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生注;ck,空白對(duì)照:檢測(cè)1.水相組飼喂;檢測(cè)2.油溶番茄紅素組.與小鼠實(shí)驗(yàn)ck組比較:p<0.05,p<0.01(n=6);&.相對(duì)酶比活計(jì)算關(guān)系為(檢測(cè)一ck)/檢測(cè)x樣液蛋白量x檢測(cè)樣品用量.這為進(jìn)步探討番茄紅素的微膠囊,納米載體核心等材料的應(yīng)用提出了思路空間.本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示番茄紅素對(duì)體內(nèi)sod,pod和cat活性都有促進(jìn)作用,尤其是pod的活性促進(jìn).李秋霞等對(duì)力竭性運(yùn)動(dòng)后小鼠肝臟檢測(cè),發(fā)現(xiàn)力竭性運(yùn)動(dòng)后肝臟的pod活性升高,但cat活性與sod活性則無(wú)顯著性變化;付妍等【9】利用旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)

21、對(duì)小鼠肝組織過(guò)氧化物酶活性影響的試驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)pod的促進(jìn)活性效果也是遠(yuǎn)高于促進(jìn)sod的效果.這說(shuō)明動(dòng)物的正常生理活動(dòng),體內(nèi)外的理化環(huán)境,包括膳食和藥物都有可能影響體內(nèi)的自由基,hoz等多種活性氧的生成.pod亦能清除體內(nèi)的h20:,但其作用機(jī)理有別于cat.番茄紅素能多方位促進(jìn)抗氧化酶系的活性,具有重要的生理意義.cat,pod等過(guò)氧化物酶類是細(xì)胞微體的主要酶類,在肝細(xì)胞或腎細(xì)胞中,可以氧化分解血液中的有毒成分,起到解毒的作用.番茄紅素在體內(nèi)參與抗氧化和上調(diào)內(nèi)源性抗氧化酶系活性,有助于進(jìn)一步研究番茄紅素對(duì)人體的防衰老,預(yù)防動(dòng)脈硬化以及調(diào)節(jié)人體免疫預(yù)防癌癥等作用機(jī)理.參考文獻(xiàn)1siesh,stahlw.lycopene:antioxidantandbiologicaleffectanditsbioavailabilityinthehumanj,procexplbiomed,1998,218(2):121-124,2趙文恩,喬憲生,俞宏,等.番茄紅素的生物學(xué)性質(zhì)jl_生物學(xué)雜志,2000,17(4):46.3李周贏,沈惠娟.幾種昆蟲(chóng)體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)活力的研究jj.昆